يوفر الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية أداة لا غنى عنها لدراسة ديناميكيات النظم البيولوجية. لكن العديد من العمليات البيولوجية -مثل انقسام الخلايا البكتيرية وانقسام الميتوكوندريا، على سبيل المثال- تحدث بشكل متقطع، مما يجعل من الصعب التقاطها.
إن التصوير المستمر لعينة بمعدل إطارات مرتفع سيضمن أنه عند حدوث مثل هذه التقسيمات، سيتم تسجيلها بالتأكيد. لكن التصوير الفلوري المفرط يسبب التبييض الضوئي ويمكن أن يدمر العينات الحية قبل الأوان. وفي الوقت نفسه، يؤدي معدل الإطارات الأبطأ إلى المخاطرة بفقدان الأحداث محل الاهتمام. ما نحتاجه هو طريقة للتنبؤ بموعد وقوع حدث ما ثم توجيه المجهر لبدء التصوير عالي السرعة.
باحثون في المعهد الفيدرالي السويسري للتكنولوجيا في لوزان (EPFL) لقد خلقوا مثل هذا النظام. قام الفريق بتطوير إطار اكتساب يحركه الحدث (EDA) يعمل على أتمتة التحكم المجهري لتصوير الأحداث البيولوجية بالتفصيل مع الحد من الضغط على العينة. باستخدام الشبكات العصبية للكشف عن السلائف الدقيقة للأحداث محل الاهتمام، تقوم EDA بتكييف معلمات الاكتساب - مثل سرعة التصوير أو مدة القياس - استجابةً لذلك.
"المجهر الذكي يشبه السيارة ذاتية القيادة. "يحتاج إلى معالجة أنواع معينة من المعلومات، والأنماط الدقيقة التي يستجيب لها بعد ذلك عن طريق تغيير سلوكه"، يوضح الباحث الرئيسي سوليانا مانلي في تصريح صحفي. "باستخدام الشبكة العصبية، يمكننا اكتشاف أحداث أكثر دقة واستخدامها لإحداث تغييرات في سرعة الاستحواذ."
إطار عمل EDA، الموصوف في طرق الطبيعة، يتكون من حلقة ردود الفعل بين دفق الصور الحية وعناصر التحكم في المجهر. استخدم الباحثون برنامج Micro-Manager لالتقاط الصور من المجهر وشبكة عصبية مدربة على البيانات المصنفة لتحليلها. بالنسبة لكل صورة، يعمل مخرج الشبكة كمعلمة لصنع القرار للتبديل بين التصوير البطيء والسريع.
التعرف على الحدث
لإثبات تقنيتهم الجديدة، قام مانلي وزملاؤه بدمج EDA في مجهر إضاءة منظم فوري واستخدموه لالتقاط أفلام متتابعة فائقة الدقة لانقسامات الميتوكوندريا والبكتيريا.
انقسام الميتوكوندريا لا يمكن التنبؤ به، وعادة ما يحدث مرة كل بضع دقائق ويستمر لعشرات الثواني. للتنبؤ ببداية الانقسام، قام الفريق بتدريب الشبكة العصبية على اكتشاف الانقباضات، وهو تغيير في شكل الميتوكوندريا يؤدي إلى الانقسام، بالإضافة إلى وجود بروتين يسمى DRP1 المطلوب للانقسامات التلقائية.
تقوم الشبكة العصبية بإخراج خريطة حرارية لـ "نتائج الأحداث"، مع قيم أعلى (عندما يكون كل من الانقباض ومستويات DRP1 عالية) تشير إلى المواقع داخل الصورة التي من المرجح أن يحدث فيها الانقسام. بمجرد أن تتجاوز درجة الحدث قيمة العتبة، تزداد سرعة التصوير لالتقاط أحداث التقسيم بالتفصيل. بمجرد تقليل النتيجة إلى عتبة ثانية، يتحول المجهر إلى التصوير منخفض السرعة لتجنب تعريض العينة للضوء الزائد.
أجرى الباحثون EDA على الخلايا التي تعبر عن علامات الفلورسنت التي تستهدف الميتوكوندريا. أثناء كل قياس لـ EDA، تعرفت الشبكة على سلائف الانقسام البكتيري تسع مرات في المتوسط. أدى هذا إلى تبديل سرعة التصوير من البطيء (0.2 إطار/ثانية) إلى السريع (3.8 إطار/ثانية) لمدة متوسطها 10 ثوانٍ، مما أدى إلى تصوير سريع لـ 18% من الإطارات. ويشيرون إلى أن العديد من المواقع تراكمت عليها DRP1 ولكنها لم تؤدي إلى الانقسام. ولم تقم هذه المواقع بتشغيل الشبكة، مما يدل على قدرتها على التمييز بين الأحداث ذات الاهتمام.
وللمقارنة، قام الفريق أيضًا بجمع الصور بسرعات بطيئة وسريعة ثابتة. تسببت جمعية الإمارات للغوص في تبييض ضوئي أقل للعينة مقارنة بالتصوير السريع بمعدل ثابت، مما أتاح مراقبة أطول لكل عينة وزيادة احتمالات التقاط أحداث انقسام الميتوكوندريا النادرة. في بعض الحالات، تم استرداد العينة من التبييض الضوئي أثناء مراحل التصوير البطيئة، مما يتيح جرعة ضوء تراكمية أعلى.
في حين أن التبييض كان أعلى مع EDA مقارنة بالتصوير البطيء المستمر، فقد وصلت العديد من جلسات EDA إلى 10 دقائق دون تدهور صحة العينة. ووجد الباحثون أيضًا أن EDA نجح في حل الانقباضات التي تسبق الانقسام بشكل أفضل، بالإضافة إلى تطور حالات الغشاء المؤدية إلى الانشطار، كما تم التقاطها من خلال دفعات الصور السريعة.
يوضح مانلي قائلاً: "تتضمن إمكانات الفحص المجهري الذكي قياس ما قد تفوته عمليات الاستحواذ القياسية". "نحن نلتقط المزيد من الأحداث ، ونقيس القيود الأصغر ، ويمكننا متابعة كل قسم بمزيد من التفصيل."
الكشف عن الانقسام البكتيري
بعد ذلك، استخدم الباحثون EDA لدراسة انقسام الخلايا في البكتيريا ج. الهلال. تحدث دورة الخلية البكتيرية في نطاق زمني يصل إلى عشرات الدقائق، مما يخلق تحديات واضحة أمام الفحص المجهري للخلية الحية. قاموا بجمع البيانات بسرعة تصوير بطيئة تبلغ 6.7 إطارًا/ساعة، وسرعة تصوير سريعة تبلغ 20 إطارًا/ساعة أو سرعة متغيرة يتم تبديلها بواسطة EDA.
ووجد الفريق أن شبكة الكشف عن الأحداث التي تم تطويرها لانقباضات الميتوكوندريا يمكنها التعرف على المراحل النهائية للانقسام البكتيري دون تدريب إضافي، ويرجع ذلك على الأرجح إلى التشابه في شكل الانقباض ووجود علامة جزيئية مماثلة وظيفيا.
تقنية الفحص المجهري المحسنة ترى الخلايا الحية بحساسية أكثر بسبع مرات
مرة أخرى، خفضت EDA التبييض الضوئي مقارنة بالتصوير السريع المستمر، وقاست الانقباضات بأقطار متوسطة أصغر بكثير من التصوير البطيء المستمر. أتاحت EDA تصوير دورة الخلية بأكملها وقدمت تفاصيل عن انقسام الخلايا البكتيرية التي يصعب التقاطها باستخدام سرعة تصوير ثابتة.
يقول مانلي عالم الفيزياء أن الفريق يخطط أيضًا لتدريب الشبكات العصبية على اكتشاف أنواع مختلفة من الأحداث واستخدامها لإثارة استجابات مختلفة للأجهزة. وتشرح قائلة: "على سبيل المثال، نتصور تسخير الاضطرابات الوراثية الضوئية لتعديل النسخ في اللحظات الرئيسية في تمايز الخلايا". "نفكر أيضًا في استخدام الكشف عن الأحداث كوسيلة لضغط البيانات، أو اختيار أجزاء البيانات الأكثر صلة بدراسة معينة لتخزينها أو تحليلها."
- لتمكين الباحثين من تنفيذ EDA على مجموعة واسعة من المجاهر، يقوم الفريق بتوفير إطار التحكم باعتباره البرنامج المساعد مفتوح المصدر لبرنامج Micro-Manager.
