RALEIGH – Kald det en CRISPR-gåde.
Bakterier bruger CRISPR-Cas-systemer som adaptive immunsystemer til at modstå angreb fra fjender som virus. Disse systemer er blevet tilpasset af forskere til at fjerne eller skære og erstatte specifikke genetiske kodesekvenser i en række forskellige organismer.
[CRISPR-Cas er et adaptivt immunsystem, der findes i de fleste bakterier og arkæer, som forhindrer dem i at blive inficeret af fager, vira og andre fremmede genetiske elementer, ifølge National Institute of Health.]
Rodolphe Barrangou (NCSU-billede)
Men i en ny undersøgelse viser forskere fra North Carolina State University, at vira, der er udviklet med et CRISPR-Cas-system, kan modvirke bakterieforsvar og foretage selektive ændringer af en målrettet bakterie – selv når andre bakterier er i nærheden.
“Virus er meget gode til at levere nyttelast. Her bruger vi en bakterievirus, en bakteriofag, til at levere CRISPR til bakterier, hvilket er ironisk, fordi bakterier normalt bruger CRISPR til at dræbe vira," sagde Rodolphe Barrangou, Todd R. Klaenhammer Distinguished Professor of Food, Bioprocessing and Nutrition Sciences ved NC State og tilsvarende forfatter til et papir, der beskriver forskningen offentliggjort i dag i Proceedings of National Academy of Sciences. "Virusen er i dette tilfælde mål E. coli ved at levere DNA til det. Det er som at bruge en virus som en sprøjte.”
NC State-forskerne indsatte to forskellige konstruerede bakteriofager til at levere CRISPR-Cas-nyttelast til målrettet redigering af E. coli, først i et reagensglas og derefter i et syntetisk jordmiljø skabt til at efterligne jord – et komplekst miljø, der kan rumme mange typer bakterier.
Begge de konstruerede bakteriofager, kaldet T7 og lambda, fandt succesfuldt og leverede derefter nyttelast til E. coli vært på laboratoriebænken. Disse nyttelaster udtrykte bakterielle fluorescerende gener og manipulerede bakteriens resistens over for et antibiotikum.
Forskerne brugte derefter lambda til at levere en såkaldt cytosinbase-editor til E. coli vært. I stedet for CRISPRs til tider hårde spaltning af DNA-sekvenser, ændrede denne baseeditor kun ét bogstav af E coli's DNA, der viser systemets følsomhed og præcision. Disse ændringer inaktiverede visse bakterielle gener uden at foretage andre ændringer E. coli.
"Vi brugte en base-editor her som en slags programmerbar tænd-sluk-knap til gener i E. coli. Ved at bruge et system som dette kan vi lave meget præcise enkeltbogstavsændringer af genomet uden det dobbeltstrengede DNA-brud, der almindeligvis er forbundet med CRISPR-Cas-målretning,” sagde Matthew Nethery, en tidligere NC State Ph.D. studerende og hovedforfatter af undersøgelsen.
Endelig demonstrerede forskerne redigering på stedet ved brug af et fremstillet økosystem (EcoFAB) fyldt med et syntetisk jordmedium af sand og kvarts, sammen med væske, for at efterligne et jordmiljø. Forskerne inkluderede også tre forskellige typer bakterier for at teste, om fagen specifikt kunne lokalisere E. coli inden for systemet.
"I et laboratorium kan videnskabsmænd forenkle tingene," sagde Barrangou. "Det er at foretrække at modellere miljøer, så i stedet for suppe i et reagensglas ønskede vi at undersøge virkelige miljøer."
Forskerne indsatte lambda i det fabrikerede økosystem. Det viste god effektivitet i at finde E. coli og lave de målrettede genetiske ændringer.
"Denne teknologi vil gøre det muligt for vores team og andre at opdage det genetiske grundlag for vigtige bakterielle interaktioner med planter og andre mikrober i stærkt kontrollerede laboratoriemiljøer såsom EcoFABs," sagde Trent Northen, en videnskabsmand ved Department of Energy's Lawrence Berkeley National Laboratory. (Berkeley Lab), som samarbejder med Barrangou.
"Vi ser dette som en mekanisme til at hjælpe mikrobiomet. Vi kan lave en ændring af en bestemt bakterie, og resten af mikrobiomet forbliver uskadt," sagde Barrangou. "Dette er et proof of concept, der kan bruges i ethvert komplekst mikrobielt samfund, hvilket kan omsættes til bedre plantesundhed og bedre mave-tarmkanalens sundhed - miljøer af betydning for mad og sundhed.
"I sidste ende repræsenterer denne undersøgelse det næste kapitel af CRISPR-levering – brug af vira til at levere CRISPR-maskineri i et komplekst miljø."
Forskerne planlægger at fremme dette arbejde ved at teste fag CRISPR-teknikken med andre jord-associerede bakterier. Det er vigtigt, at dette illustrerer, hvordan jordens mikrobielle samfund kan manipuleres til at kontrollere sammensætningen og funktionen af bakterier forbundet med planter i fremstillede økosystemer for at forstå, hvordan man kan forbedre plantevækst og fremme plantesundhed, hvilket er af bred interesse for bæredygtigt landbrug.
Finansiering blev leveret af m-CAFEs Microbial Community Analysis & Functional Evaluation in Soils, et videnskabeligt fokusområde ledet af Lawrence Berkeley National Laboratory og støttet af US Department of Energy under kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231, med samarbejdsindsats, herunder UC Berkeley og Innovative Genomics Institute. Medforfattere til papiret inkluderer Nethery, tidligere NC State post-doc forsker Claudio Hidalgo-Cantabrana og NC State kandidatstuderende Avery Roberts.
(C) NCSU
