Fluorescensmikroskopi af levende celler giver et uundværligt værktøj til at studere dynamikken i biologiske systemer. Men mange biologiske processer - såsom bakteriel celledeling og mitokondriedeling, for eksempel - forekommer sporadisk, hvilket gør dem udfordrende at fange.
Kontinuerlig billeddannelse af en prøve ved en høj billedhastighed ville sikre, at når sådanne opdelinger forekommer, vil de helt sikkert blive registreret. Men overdreven fluorescensbilleddannelse forårsager fotoblegning og kan ødelægge levende prøver for tidligt. En langsommere billedhastighed risikerer i mellemtiden at gå glip af interessante begivenheder. Det, der er brug for, er en måde at forudsige, hvornår en begivenhed er ved at ske, og derefter instruere mikroskopet til at begynde højhastighedsbilleddannelse.
Forskere ved Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL) har skabt netop sådan et system. Holdet udviklede en hændelsesdrevet erhvervelse (EDA) ramme, der automatiserer mikroskopkontrol til at afbilde biologiske hændelser i detaljer, mens stress på prøven begrænses. Ved at bruge neurale netværk til at detektere subtile forløbere for begivenheder af interesse, tilpasser EDA optagelsesparametrene - såsom billedhastighed eller målingens varighed - som reaktion.
"Et intelligent mikroskop er lidt som en selvkørende bil. Den skal behandle visse typer information, subtile mønstre, som den derefter reagerer på ved at ændre sin adfærd,” forklarer hovedefterforsker. Suliana Manley i en pressemeddelelse. "Ved at bruge et neuralt netværk kan vi registrere meget mere subtile hændelser og bruge dem til at drive ændringer i optagelseshastigheden."
EDA-rammen, beskrevet i Naturmetoder, består af en feedback-loop mellem en live billedstream og mikroskopkontrollerne. Forskerne brugte Micro-Manager-software til at fange billeder fra mikroskopet og et neuralt netværk trænet på mærkede data til at analysere dem. For hvert billede fungerer netværksoutput som en beslutningsparameter til at skifte mellem langsom og hurtig billeddannelse.
Begivenhedsgenkendelse
For at demonstrere deres nye teknik integrerede Manley og sine kolleger EDA i et øjeblikkeligt struktureret belysningsmikroskop og brugte det til at fange superopløste time-lapse-film af mitokondrie- og bakterieopdelinger.
Mitokondriel deling er uforudsigelig og forekommer typisk en gang med få minutter mellemrum og varer titusinder af sekunder. For at forudsige begyndelsen af deling trænede holdet det neurale netværk til at opdage forsnævringer, en ændring i mitokondriel form, der fører til deling, kombineret med tilstedeværelsen af et protein kaldet DRP1, der er påkrævet til spontane delinger.
Det neurale netværk udsender et varmekort med "hændelsesscore" med højere værdier (når både forsnævringer og DRP1-niveauer er høje), der angiver steder i billedet, hvor der er større sandsynlighed for, at der opstår deling. Når hændelsesscoren overstiger en tærskelværdi, øges billedhastigheden for at fange divisionsbegivenhederne i detaljer. Når scoren er reduceret til en anden tærskel, skifter mikroskopet til lavhastighedsbilleddannelse for at undgå at udsætte prøven for meget lys.
Forskerne udførte EDA på celler, der udtrykker mitokondrier-målrettede fluorescerende mærker. Under hver EDA-måling genkendte netværket forstadier til bakteriel deling ni gange i gennemsnit. Dette skiftede billedhastigheden fra langsom (0.2 billeder/s) til hurtig (3.8 billeder/s) i gennemsnitligt 10 s, hvilket resulterede i hurtig billeddannelse for 18 % af billederne. De bemærker, at mange websteder akkumulerede DRP1, men førte ikke til opdeling. Disse websteder udløste ikke netværket, hvilket viser dets evne til at diskriminere begivenheder af interesse.
Til sammenligning indsamlede holdet også billeder ved konstant langsomme og hurtige hastigheder. EDA forårsagede mindre prøvefotoblegning end fast-rate hurtig billeddannelse, hvilket muliggjorde længere observationer af hver prøve og øgede chancerne for at fange sjældne mitokondriedelingsbegivenheder. I nogle tilfælde kom prøven sig fra fotoblegning under de langsomme billeddannelsesfaser, hvilket muliggjorde en højere kumulativ lysdosis.
Mens blegning var højere med EDA end for konstant langsom billeddannelse, nåede mange EDA-sessioner 10 minutter uden forringelse af prøvens sundhed. Forskerne fandt også ud af, at EDA bedre løste de indsnævringer, der gik forud for delingen, såvel som progressionen af membrantilstande, der førte til fission, som fanget af udbrud af hurtige billeder.
"Potentialet ved intelligent mikroskopi omfatter måling af, hvad standardopkøb ville gå glip af," forklarer Manley. "Vi fanger flere begivenheder, måler mindre indsnævringer og kan følge hver division mere detaljeret."
Detektering af bakteriel deling
Dernæst brugte forskerne EDA til at studere celledeling i bakterierne C. crescentus. Den bakterielle cellecyklus finder sted på en tidsskala på ti minutter, hvilket skaber særskilte udfordringer for mikroskopi med levende celler. De indsamlede data ved en langsom billedhastighed på 6.7 billeder/time, en hurtig billeddannelseshastighed på 20 billeder/time eller en variabel hastighed skiftet af EDA.
Holdet fandt ud af, at hændelsesdetektionsnetværket udviklet til mitokondrielle forsnævringer kunne genkende de sidste stadier af bakteriel deling uden yderligere træning - sandsynligvis på grund af ligheder i indsnævringsform og tilstedeværelsen af en funktionelt lignende molekylær markør.
Forbedret mikroskopiteknik ser levende celler med syv gange mere følsomhed
Igen reducerede EDA fotoblegning sammenlignet med konstant hurtig billeddannelse og målte forsnævringer med væsentligt mindre gennemsnitlige diametre end med konstant langsom billeddannelse. EDA muliggjorde billeddannelse af hele cellecyklussen og gav detaljer om bakteriel celledeling, der er svære at fange ved hjælp af en fast billeddannelseshastighed.
Manley fortæller Fysik verden at holdet også planlægger at træne neurale netværk til at detektere forskellige slags hændelser og bruge disse til at fremkalde forskellige hardware-svar. "For eksempel forestiller vi os at udnytte optogenetiske forstyrrelser til at modulere transkription på vigtige tidspunkter i celledifferentiering," forklarer hun. "Vi tænker også på at bruge hændelsesdetektion som et middel til datakomprimering, udvælgelse til lagring eller analyse af de data, der er mest relevante for en given undersøgelse."
- For at gøre det muligt for forskere at implementere EDA på en bred vifte af mikroskoper, leverer holdet kontrolrammen som en open source plug-in til Micro-Manager-softwaren.
