Ekspansionsmikroskopi muliggør nanobilleddannelse med et konventionelt mikroskop

Ekspansionsmikroskopi er en biologisk billeddannelsesteknik, der muliggør billeddannelse i nanoskala ved hjælp af et konventionelt diffraktionsbegrænset fluorescensmikroskop. Det virker ved at indlejre prøver i en vand-kvældbar hydrogel og derefter udvide gelen. Dette udvider biomolekylerne fysisk væk fra hinanden, hvilket gør det muligt at afhøre dem i en opløsning, der tidligere kun var opnået ved brug af dyre højopløselige billedbehandlingsteknikker.

Nuværende ekspansionsmikroskopiprotokoller er dog ikke optimeret til udbredt anvendelse. Prøver skal behandles med tilpassede forankringsmidler for at forbinde specifikke biomolekyler og etiketter til hydrogelen. Derudover har de fleste tilgange kun opnået omtrent fire gange vævsudvidelse, hvilket begrænser den effektive opløsning til omkring 70 nm på et konventionelt optisk mikroskop med en 280 nm diffraktionsbegrænset objektivlinse.

For at overvinde disse mangler gik et hold op kl Carnegie Mellon University har udviklet en ny ekspansionsmikroskopi-strategi kaldet Magnify. Protokollen, beskrevet i Nature Biotechnology, bruger en ny mekanisk robust hydrogel, der bevarer et spektrum af biomolekyler uden at kræve et separat forankringstrin.

Magnify kan udvide prøverne med op til 11 gange, hvilket muliggør billeddannelse af celler og væv med en effektiv opløsning på omkring 25 nm ved hjælp af et konventionelt mikroskop. Når det kombineres med optisk udsvingsbilleddannelse med superopløsning (SOFI, en beregningsmæssig efterbehandlingsmetode), opnåede den en effektiv opløsning på omkring 15 nm.

Tidligere ekspansionsmikroskopiprotokoller krævede også eliminering af mange biomolekyler, der holder væv sammen. "For at gøre celler virkelig udvidelige, skal du bruge enzymer til at fordøje proteiner, så til sidst havde du en tom gel med etiketter, der angiver placeringen af ​​proteinet af interesse," forklarer seniorforfatter Yongxin Zhao i en pressemeddelelse.

"Et af de vigtigste salgsargumenter for Magnify er den universelle strategi til at holde vævets biomolekyler, inklusive proteiner, nukleinsyrer og kulhydrater, inden for den udvidede prøve. Molekylerne holdes intakte, og flere typer biomolekyler kan mærkes i en enkelt prøve,” tilføjer Zhao.

Brede applikationer

Zhao og kolleger anvendte Magnify på en lang række vævstyper. Billeddannelse af et 11-fold udvidet musehjerneafsnit farvet for totalt proteinindhold, muliggjorde for eksempel visualisering af den nanoskopiske arkitektur af individuelle synapser i hjernen. Magnify demonstrerede en effektiv opløsningsevne på omkring 18 nm ved hjælp af en ×60 objektivlinse (omkring 200 nm diffraktionsgrænse).

Forskerne bekræftede den lave forvrængning opnået af Magnify-protokollen på flere vævstyper ved hjælp af SOFI præ-ekspansion og konfokal mikroskopi efter ekspansion. De fandt ingen væsentlige morfologiske ændringer mellem præ- og post-ekspansionsbilleder af cellekerner og proteinmarkører på hverken makroskopiske eller sub-diffraktionsniveauer.

Holdet testede også Magnify på en række formalinfikserede paraffinindlejrede prøver - som er blandt de vigtigste biopsipræparater, men som er udfordrende at udvide med nuværende protokoller. Dette omfattede vævssnit fra nyre, bryst, hjerne og tyktarm og tilsvarende tumorer. Magnify kunne udvide prøverne med faktorer på omkring 8.00-10.77 i vand, afhængigt af vævstype.

Et centralt mål var at gøre Magnify velegnet til en bred vifte af vævsprøver og lette dets optagelse af forskere, der ønsker at vedtage den nye protokol. "Det virker med forskellige vævstyper, fikseringsmetoder og endda væv, der er blevet konserveret og opbevaret," siger medforfatter. Brendan Gallagher. ”Det er meget fleksibelt, idet man ikke nødvendigvis behøver at redesigne eksperimenter helt med Magnify i tankerne; det vil fungere med det, du allerede har."

Ramper opløsningen

For at demonstrere den yderligere stigning i effektiv opløsning, der er muliggjort ved at parre Magnify med SOFI, brugte forskerne kombinationen til at afbilde menneskelige lungeorganoider, især flimmerhårene, der fungerer til at fjerne slim i luftvejene. Ved 200 nm i diameter og blot et par mikrometer i længden er disse strukturer normalt for små til at se uden brug af teknologi såsom elektronmikroskopi (EM).

Magnify-SOFI kunne fuldt ud løse den hule struktur af cilia og basale legemer, inklusive den ydre ring, som tidligere er vist af EM til at omfatte ni bundter af mikrotubuli. Forskerne estimerede den effektive opløsning til omkring 14-17 nm (ved brug af en 280 nm diffraktionsbegrænset objektivlinse). De var også i stand til at visualisere defekter i cilia i lungeceller med genetiske mutationer.

Superopløsningsmikroskopi afslører coronavirus-replikerende maskineri

"Med de nyeste Magnify-teknikker kan vi udvide disse lungevæv og begynde at se noget ultrastruktur af de bevægelige cilia selv med et almindeligt mikroskop, og dette vil fremskynde både grundlæggende og kliniske undersøgelser," kommenterer medforfatter. Xi Ren.

Med udgangspunkt i den vellykkede udvikling af Magnify bruger teamet det nu til at studere endnu mere komplekse vævsprøver. "Dette inkluderer udforskning af inficeret væv såvel som større prøver såsom hele organer," fortæller Zhao Fysik verden. "Desuden arbejder vi på at optimere Magnify til at undersøge patologiske prøver fra mennesker og studere ændringer i nanoskala i hjernen under læreprocesser og sygdomme. Med disse gennembrud kan der forventes yderligere opdagelser fra dette meget lovende studieområde."

• SEO Powered Content & PR Distribution. Bliv forstærket i dag.
• Platoblokkæde. Web3 Metaverse Intelligence. Viden forstærket. Adgang her.
• Kilde: https://physicsworld.com/a/expansion-microscopy-enables-nanoimaging-with-a-conventional-microscope/