RALEIGH – Nennen wir es ein CRISPR-Rätsel.
Bakterien nutzen CRISPR-Cas-Systeme als adaptives Immunsystem, um Angriffen von Feinden wie Viren standzuhalten. Diese Systeme wurden von Wissenschaftlern angepasst, um bestimmte genetische Codesequenzen in einer Vielzahl von Organismen zu entfernen oder auszuschneiden und zu ersetzen.
[CRISPR-Kas ist ein adaptives Immunsystem, das in den meisten Bakterien und Archaeen vorkommt und diese vor einer Infektion durch Phagen, Viren und andere fremde genetische Elemente schützt, so das National Institute of Health.]
Rodolphe Barrangou (NCSU-Foto)
Aber in einer neuen Studie zeigen Forscher der North Carolina State University, dass mit einem CRISPR-Cas-System hergestellte Viren die bakterielle Abwehr durchkreuzen und selektive Veränderungen an einem Zielbakterium vornehmen können – selbst wenn sich andere Bakterien in unmittelbarer Nähe befinden.
„Viren sind sehr gut darin, Nutzlasten zu übermitteln. Hier verwenden wir ein bakterielles Virus, einen Bakteriophagen, um CRISPR an Bakterien weiterzugeben, was ironisch ist, weil Bakterien normalerweise CRISPR verwenden, um Viren abzutöten“, sagte er Rodolphe Barrangou, der Todd R. Klaenhammer Distinguished Professor für Lebensmittel-, Bioverarbeitungs- und Ernährungswissenschaften an der NC State und korrespondierender Autor eines Artikels, der die heute in veröffentlichten Forschungsarbeiten beschreibt Proceedings of the National Academy of Sciences. „Der Virus zielt in diesem Fall ab E. coli indem man ihm DNA zuführt. Es ist, als würde man einen Virus als Spritze verwenden.“
Die Forscher des NC State setzten zwei verschiedene manipulierte Bakteriophagen ein, um CRISPR-Cas-Nutzlasten für die gezielte Bearbeitung von bereitzustellen E. coli, zuerst in einem Reagenzglas und dann in einer synthetischen Bodenumgebung, die so geschaffen wurde, dass sie den Boden nachahmt – eine komplexe Umgebung, die viele Arten von Bakterien beherbergen kann.
Beide manipulierten Bakteriophagen, T7 und Lambda genannt, fanden erfolgreich Nutzlasten und lieferten sie dann an die E. coli Gastgeber auf dem Labortisch. Diese Nutzlasten exprimierten bakterielle Fluoreszenzgene und manipulierten die Resistenz des Bakteriums gegenüber einem Antibiotikum.
Anschließend lieferten die Forscher mithilfe von Lambda einen sogenannten Cytosin-Basen-Editor E. coli Gastgeber. Anstelle der manchmal harten Spaltung von DNA-Sequenzen durch CRISPR hat dieser Basiseditor nur einen Buchstaben von geändert E coli 's DNA, die die Empfindlichkeit und Präzision des Systems zeigt. Diese Veränderungen inaktivierten bestimmte bakterielle Gene, ohne andere Veränderungen vorzunehmen E. coli.
„Wir haben hier einen Basiseditor als eine Art programmierbaren Ein-Aus-Schalter für Gene verwendet E. coli. Mit einem System wie diesem können wir hochpräzise Einzelbuchstabenänderungen am Genom vornehmen, ohne den Doppelstrang-DNA-Bruch, der üblicherweise mit dem CRISPR-Cas-Targeting einhergeht“, sagte Matthew Nethery, ein ehemaliger NC State Ph.D. Student und Hauptautor der Studie.
Schließlich demonstrierten die Forscher die Bearbeitung vor Ort mithilfe eines künstlichen Ökosystems (EcoFAB), das mit einem synthetischen Bodenmedium aus Sand und Quarz sowie Flüssigkeit beladen war, um eine Bodenumgebung nachzuahmen. Die Forscher schlossen auch drei verschiedene Arten von Bakterien ein, um zu testen, ob der Phagen spezifisch lokalisieren konnte E. coli innerhalb des Systems.
„In einem Labor können Wissenschaftler die Dinge zu stark vereinfachen“, sagte Barrangou. „Es ist besser, Umgebungen zu modellieren, daher wollten wir statt Suppe im Reagenzglas reale Umgebungen untersuchen.“
Die Forscher fügten Lambda in das künstliche Ökosystem ein. Es zeigte eine gute Effizienz bei der Suche E. coli und die gezielten genetischen Veränderungen vorzunehmen.
„Diese Technologie wird es unserem Team und anderen ermöglichen, die genetische Grundlage wichtiger bakterieller Interaktionen mit Pflanzen und anderen Mikroben in streng kontrollierten Laborumgebungen wie EcoFABs zu entdecken“, sagte Trent Northen, Wissenschaftler am Lawrence Berkeley National Laboratory des Energieministeriums (Berkeley Lab), der mit Barrangou zusammenarbeitet.
„Wir betrachten dies als einen Mechanismus zur Unterstützung des Mikrobioms. „Wir können eine Veränderung an einem bestimmten Bakterium vornehmen und der Rest des Mikrobioms bleibt unversehrt“, sagte Barrangou. „Dies ist ein Proof of Concept, der in jeder komplexen mikrobiellen Gemeinschaft eingesetzt werden könnte, was zu einer besseren Pflanzengesundheit und einer besseren Gesundheit des Magen-Darm-Trakts führen könnte – Umgebungen, die für Ernährung und Gesundheit wichtig sind.“
„Letztendlich stellt diese Studie das nächste Kapitel der CRISPR-Bereitstellung dar – die Verwendung von Viren zur Bereitstellung von CRISPR-Maschinen in einer komplexen Umgebung.“
Die Forscher planen, diese Arbeit voranzutreiben, indem sie die Phagen-CRISPR-Technik mit anderen bodenassoziierten Bakterien testen. Dies zeigt vor allem, wie Bodenmikrobengemeinschaften manipuliert werden können, um die Zusammensetzung und Funktion von Bakterien zu kontrollieren, die mit Pflanzen in künstlichen Ökosystemen assoziiert sind, um zu verstehen, wie das Pflanzenwachstum gesteigert und die Pflanzengesundheit gefördert werden kann, was für eine nachhaltige Landwirtschaft von großem Interesse ist.
Die Finanzierung erfolgte durch m-CAFEs „Microbial Community Analysis & Functional Evaluation in Soils“, einem wissenschaftlichen Schwerpunktbereich, der vom Lawrence Berkeley National Laboratory geleitet und vom US-Energieministerium im Rahmen der Vertragsnummer unterstützt wird. DE-AC02-05CH11231, mit Kooperationen unter Beteiligung der UC Berkeley und des Innovative Genomics Institute. Zu den Co-Autoren des Papiers gehören Nethery, der ehemalige Postdoktorand des NC State, Claudio Hidalgo-Cantabrana, und der Doktorand des NC State, Avery Roberts.
(C) NCSU
