Die Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen ist ein unverzichtbares Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik biologischer Systeme. Doch viele biologische Prozesse – wie zum Beispiel die bakterielle Zellteilung und die Mitochondrienteilung – laufen sporadisch ab und sind deshalb schwer zu erfassen.
Die kontinuierliche Abbildung einer Probe mit einer hohen Bildrate würde sicherstellen, dass solche Teilungen, wenn sie auftreten, definitiv aufgezeichnet werden. Eine übermäßige Fluoreszenzbildgebung führt jedoch zu Photobleichung und kann lebende Proben vorzeitig zerstören. Bei einer langsameren Bildrate besteht hingegen die Gefahr, dass interessante Ereignisse übersehen werden. Was benötigt wird, ist eine Möglichkeit, vorherzusagen, wann ein Ereignis eintreten wird, und dann das Mikroskop anzuweisen, mit der Hochgeschwindigkeitsbildgebung zu beginnen.
Forscher der Eidgenössischen Technischen Hochschule Lausanne (EPFL) haben ein solches System geschaffen. Das Team entwickelte ein EDA-Framework (Event-Driven Acquisition), das die Mikroskopsteuerung automatisiert, um biologische Ereignisse detailliert abzubilden und gleichzeitig die Belastung der Probe zu begrenzen. Mithilfe neuronaler Netze zur Erkennung subtiler Vorläufer von Ereignissen von Interesse passt EDA als Reaktion darauf die Erfassungsparameter – wie Bildgebungsgeschwindigkeit oder Messdauer – an.
„Ein intelligentes Mikroskop ist so etwas wie ein selbstfahrendes Auto. Es muss bestimmte Arten von Informationen verarbeiten, subtile Muster, auf die es dann mit einer Verhaltensänderung reagiert“, erklärt der Hauptforscher Suliana Manley in einer Pressemitteilung. „Durch den Einsatz eines neuronalen Netzwerks können wir viel subtilere Ereignisse erkennen und sie nutzen, um Änderungen in der Erfassungsgeschwindigkeit voranzutreiben.“
Das EDA-Framework, beschrieben in Nature Methods, besteht aus einer Rückkopplungsschleife zwischen einem Live-Bildstrom und den Mikroskopsteuerungen. Die Forscher verwendeten die Micro-Manager-Software, um Bilder vom Mikroskop aufzunehmen, und ein neuronales Netzwerk, das auf markierten Daten trainiert wurde, um sie zu analysieren. Für jedes Bild fungiert der Netzwerkausgang als Entscheidungsparameter zum Umschalten zwischen langsamer und schneller Bildgebung.
Ereigniserkennung
Um ihre neue Technik zu demonstrieren, integrierten Manley und Kollegen EDA in ein Sofortmikroskop mit strukturierter Beleuchtung und machten damit hochaufgelöste Zeitrafferfilme von Mitochondrien- und Bakterienteilungen.
Die mitochondriale Teilung ist unvorhersehbar, erfolgt typischerweise alle paar Minuten und dauert mehrere zehn Sekunden. Um den Beginn der Teilung vorherzusagen, trainierte das Team das neuronale Netzwerk darauf, Verengungen zu erkennen, eine Veränderung der mitochondrialen Form, die zur Teilung führt, kombiniert mit dem Vorhandensein eines Proteins namens DRP1, das für spontane Teilungen erforderlich ist.
Das neuronale Netzwerk gibt eine Wärmekarte der „Ereigniswerte“ aus, wobei höhere Werte (wenn sowohl die Einschnürungen als auch die DRP1-Werte hoch sind) Stellen im Bild angeben, an denen eine Teilung wahrscheinlicher ist. Sobald der Ereigniswert einen Schwellenwert überschreitet, erhöht sich die Bildgebungsgeschwindigkeit, um die Teilungsereignisse detailliert zu erfassen. Sobald der Wert auf einen zweiten Schwellenwert sinkt, schaltet das Mikroskop auf langsame Bildgebung um, um zu vermeiden, dass die Probe übermäßigem Licht ausgesetzt wird.
Die Forscher führten eine EDA an Zellen durch, die auf Mitochondrien gerichtete Fluoreszenzmarkierungen exprimierten. Bei jeder EDA-Messung erkannte das Netzwerk durchschnittlich neunmal Vorläufer der Bakterienteilung. Dadurch wurde die Bildgeschwindigkeit für durchschnittlich 0.2 s von langsam (3.8 Bilder/s) auf schnell (10 Bilder/s) umgeschaltet, was zu einer schnellen Bildaufnahme bei 18 % der Bilder führte. Sie stellen fest, dass sich an vielen Standorten DRP1 ansammelte, dies jedoch nicht zur Teilung führte. Diese Websites haben das Netzwerk nicht ausgelöst, was seine Fähigkeit unter Beweis stellt, Ereignisse von Interesse zu unterscheiden.
Zum Vergleich sammelte das Team auch Bilder bei konstanter langsamer und schneller Geschwindigkeit. EDA verursachte eine geringere Photobleichung der Probe als schnelle Bildgebung mit fester Rate, was längere Beobachtungen jeder Probe ermöglichte und die Wahrscheinlichkeit erhöhte, seltene mitochondriale Teilungsereignisse zu erfassen. In einigen Fällen erholte sich die Probe von der Photobleichung während der langsamen Bildgebungsphasen, was eine höhere kumulative Lichtdosis ermöglichte.
Während die Ausbleichung bei EDA höher war als bei konstant langsamer Bildgebung, erreichten viele EDA-Sitzungen 10 Minuten ohne Beeinträchtigung der Probengesundheit. Die Forscher fanden außerdem heraus, dass EDA die Verengungen vor der Teilung sowie das Fortschreiten der Membranzustände, die zur Spaltung führen, besser auflöste, wie durch die Ausbrüche schneller Bilder erfasst.
„Das Potenzial der intelligenten Mikroskopie besteht darin, zu messen, was bei Standardaufnahmen fehlen würde“, erklärt Manley. „Wir erfassen mehr Ereignisse, messen kleinere Engpässe und können jede Teilung detaillierter verfolgen.“
Erkennung der Bakterienteilung
Als nächstes untersuchten die Forscher mithilfe von EDA die Zellteilung der Bakterien C. crescentus. Der bakterielle Zellzyklus dauert mehrere zehn Minuten und stellt die Mikroskopie lebender Zellen vor besondere Herausforderungen. Sie sammelten Daten mit einer langsamen Bildgeschwindigkeit von 6.7 Bildern/h, einer schnellen Bildgeschwindigkeit von 20 Bildern/h oder einer durch EDA umschaltbaren variablen Geschwindigkeit.
Das Team fand heraus, dass das für mitochondriale Verengungen entwickelte Ereigniserkennungsnetzwerk die Endstadien der Bakterienteilung ohne zusätzliches Training erkennen konnte – wahrscheinlich aufgrund von Ähnlichkeiten in der Verengungsform und dem Vorhandensein eines funktionell ähnlichen molekularen Markers.
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Auch hier reduzierte die EDA die Photobleichung im Vergleich zur konstant schnellen Bildgebung und maß Einschnürungen mit deutlich kleineren durchschnittlichen Durchmessern als bei der konstant langsamen Bildgebung. EDA ermöglichte die Bildgebung des gesamten Zellzyklus und lieferte Details der bakteriellen Zellteilung, die mit einer festen Bildgebungsgeschwindigkeit schwer zu erfassen sind.
Manley erzählt Physik-Welt dass das Team auch plant, neuronale Netze zu trainieren, um verschiedene Arten von Ereignissen zu erkennen und diese zu nutzen, um unterschiedliche Hardware-Reaktionen hervorzurufen. „Wir stellen uns zum Beispiel vor, optogenetische Störungen zu nutzen, um die Transkription in Schlüsselmomenten der Zelldifferenzierung zu modulieren“, erklärt sie. „Wir denken auch darüber nach, die Ereigniserkennung als Mittel zur Datenkomprimierung zu nutzen und die Datenteile zur Speicherung oder Analyse auszuwählen, die für eine bestimmte Studie am relevantesten sind.“
- Um Forschern die Implementierung von EDA auf einer Vielzahl von Mikroskopen zu ermöglichen, stellt das Team das Kontroll-Framework als zur Verfügung Open-Source-Plugin für die Micro-Manager-Software.
