Η μικροσκοπία φθορισμού ζωντανών κυττάρων παρέχει ένα απαραίτητο εργαλείο για τη μελέτη της δυναμικής των βιολογικών συστημάτων. Αλλά πολλές βιολογικές διεργασίες – όπως η βακτηριακή κυτταρική διαίρεση και η μιτοχονδριακή διαίρεση, για παράδειγμα – συμβαίνουν σποραδικά, γεγονός που καθιστά δύσκολη τη σύλληψή τους.
Η συνεχής απεικόνιση ενός δείγματος με υψηλό ρυθμό καρέ θα εξασφάλιζε ότι όταν συμβούν τέτοιες διαιρέσεις, θα καταγραφούν σίγουρα. Όμως η υπερβολική απεικόνιση φθορισμού προκαλεί φωτολεύκανση και μπορεί να καταστρέψει πρόωρα ζωντανά δείγματα. Ένας χαμηλότερος ρυθμός καρέ, εν τω μεταξύ, κινδυνεύει να χάσει γεγονότα ενδιαφέροντος. Αυτό που χρειάζεται είναι ένας τρόπος να προβλέψουμε πότε πρόκειται να συμβεί ένα γεγονός και στη συνέχεια να δώσουμε εντολή στο μικροσκόπιο να ξεκινήσει απεικόνιση υψηλής ταχύτητας.
Ερευνητές στο Ελβετικό Ομοσπονδιακό Ινστιτούτο Τεχνολογίας της Λωζάνης (EPFL) έχουν δημιουργήσει ακριβώς ένα τέτοιο σύστημα. Η ομάδα ανέπτυξε ένα πλαίσιο απόκτησης βάσει συμβάντων (EDA) που αυτοματοποιεί τον έλεγχο του μικροσκοπίου για την λεπτομερή απεικόνιση βιολογικών γεγονότων, περιορίζοντας ταυτόχρονα την πίεση στο δείγμα. Χρησιμοποιώντας νευρωνικά δίκτυα για την ανίχνευση λεπτών πρόδρομων γεγονότων ενδιαφέροντος, το EDA προσαρμόζει τις παραμέτρους απόκτησης – όπως η ταχύτητα απεικόνισης ή η διάρκεια μέτρησης – σε απόκριση.
«Ένα έξυπνο μικροσκόπιο μοιάζει με αυτό-οδηγούμενο αυτοκίνητο. Χρειάζεται να επεξεργάζεται ορισμένους τύπους πληροφοριών, διακριτικά μοτίβα στα οποία στη συνέχεια ανταποκρίνεται αλλάζοντας τη συμπεριφορά του», εξηγεί ο κύριος ερευνητής. Suliana Manley σε δήλωση τύπου. «Χρησιμοποιώντας ένα νευρωνικό δίκτυο, μπορούμε να ανιχνεύσουμε πολύ πιο λεπτά συμβάντα και να τα χρησιμοποιήσουμε για να οδηγήσουμε σε αλλαγές στην ταχύτητα απόκτησης».
Το πλαίσιο EDA, που περιγράφεται στο Μέθοδοι φύσης, αποτελείται από έναν βρόχο ανάδρασης μεταξύ μιας ζωντανής ροής εικόνας και των στοιχείων ελέγχου του μικροσκοπίου. Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν το λογισμικό Micro-Manager για τη λήψη εικόνων από το μικροσκόπιο και ένα νευρωνικό δίκτυο εκπαιδευμένο σε δεδομένα με ετικέτα για την ανάλυσή τους. Για κάθε εικόνα, η έξοδος δικτύου λειτουργεί ως παράμετρος λήψης αποφάσεων για εναλλαγή μεταξύ αργής και γρήγορης απεικόνισης.
Αναγνώριση συμβάντος
Για να επιδείξουν τη νέα τους τεχνική, ο Manley και οι συνεργάτες του ενσωμάτωσαν το EDA σε ένα μικροσκόπιο στιγμιαίου δομημένου φωτισμού και το χρησιμοποίησαν για να καταγράψουν εξαιρετικά αναλυμένες ταινίες time-lapse μιτοχονδριακών και βακτηριακών διαιρέσεων.
Η μιτοχονδριακή διαίρεση είναι απρόβλεπτη, συνήθως συμβαίνει μία φορά κάθε λίγα λεπτά και διαρκεί δεκάδες δευτερόλεπτα. Για να προβλέψει την έναρξη της διαίρεσης, η ομάδα εκπαίδευσε το νευρωνικό δίκτυο να ανιχνεύει συστολές, μια αλλαγή στο σχήμα των μιτοχονδρίων που οδηγεί σε διαίρεση, σε συνδυασμό με την παρουσία μιας πρωτεΐνης που ονομάζεται DRP1 που απαιτείται για τις αυθόρμητες διαιρέσεις.
Το νευρωνικό δίκτυο εξάγει έναν θερμικό χάρτη «βαθμών γεγονότων», με υψηλότερες τιμές (όταν τόσο οι συστολές όσο και τα επίπεδα DRP1 είναι υψηλά) υποδεικνύοντας θέσεις εντός της εικόνας όπου είναι πιο πιθανό να συμβεί διαίρεση. Μόλις η βαθμολογία συμβάντος υπερβεί μια τιμή κατωφλίου, η ταχύτητα απεικόνισης αυξάνεται για να καταγράψει λεπτομερώς τα συμβάντα διαίρεσης. Μόλις η βαθμολογία μειωθεί σε ένα δεύτερο όριο, το μικροσκόπιο μεταβαίνει σε απεικόνιση χαμηλής ταχύτητας για να αποφευχθεί η έκθεση του δείγματος σε υπερβολικό φως.
Οι ερευνητές πραγματοποίησαν EDA σε κύτταρα που εκφράζουν φθορίζουσες ετικέτες στοχευμένες σε μιτοχόνδρια. Κατά τη διάρκεια κάθε μέτρησης EDA, το δίκτυο αναγνώριζε πρόδρομες ουσίες της βακτηριακής διαίρεσης εννέα φορές κατά μέσο όρο. Αυτό άλλαξε την ταχύτητα απεικόνισης από αργή (0.2 καρέ/δευτερόλεπτο) σε γρήγορη (3.8 καρέ/δευτερόλεπτο) κατά μέσο όρο για 10 δευτερόλεπτα, με αποτέλεσμα γρήγορη απεικόνιση για το 18% των καρέ. Σημειώνουν ότι πολλές τοποθεσίες συσσώρευσαν DRP1 αλλά δεν οδήγησαν σε διαίρεση. Αυτοί οι ιστότοποι δεν ενεργοποίησαν το δίκτυο, αποδεικνύοντας την ικανότητά του να διακρίνει γεγονότα ενδιαφέροντος.
Για σύγκριση, η ομάδα συνέλεξε επίσης εικόνες σε σταθερές αργές και γρήγορες ταχύτητες. Το EDA προκάλεσε λιγότερη φωτολεύκανση δείγματος από τη γρήγορη απεικόνιση σταθερού ρυθμού, επιτρέποντας μεγαλύτερες παρατηρήσεις για κάθε δείγμα και αυξάνοντας τις πιθανότητες σύλληψης σπάνιων συμβάντων μιτοχονδριακής διαίρεσης. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το δείγμα ανακτήθηκε από τη φωτολεύκανση κατά τις αργές φάσεις απεικόνισης, επιτρέποντας υψηλότερη αθροιστική δόση φωτός.
Ενώ η λεύκανση ήταν υψηλότερη με το EDA από ό,τι για τη σταθερή αργή απεικόνιση, πολλές συνεδρίες EDA έφτασαν τα 10 λεπτά χωρίς υποβάθμιση της υγείας του δείγματος. Οι ερευνητές ανακάλυψαν επίσης ότι το EDA επέλυε καλύτερα τις συστολές που προηγήθηκαν της διαίρεσης, καθώς και την εξέλιξη των καταστάσεων της μεμβράνης που οδηγούσαν σε σχάση, όπως καταγράφηκε από τις εκρήξεις γρήγορων εικόνων.
«Οι δυνατότητες της ευφυούς μικροσκοπίας περιλαμβάνει τη μέτρηση του τι θα έλειπαν οι τυπικές αποκτήσεις», εξηγεί ο Manley. «Καταγράφουμε περισσότερα γεγονότα, μετράμε μικρότερες στενώσεις και μπορούμε να παρακολουθήσουμε κάθε διαίρεση με μεγαλύτερη λεπτομέρεια».
Ανίχνευση βακτηριακής διαίρεσης
Στη συνέχεια, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν το EDA για να μελετήσουν την κυτταρική διαίρεση στα βακτήρια C. crescentus. Ο βακτηριακός κυτταρικός κύκλος συμβαίνει σε χρονική κλίμακα δεκάδων λεπτών, δημιουργώντας ξεχωριστές προκλήσεις για τη μικροσκοπία ζωντανών κυττάρων. Συνέλεξαν δεδομένα με αργή ταχύτητα απεικόνισης 6.7 καρέ/ώρα, γρήγορη ταχύτητα απεικόνισης 20 καρέ/ώρα ή μεταβλητή ταχύτητα που αλλάζει από την EDA.
Η ομάδα διαπίστωσε ότι το δίκτυο ανίχνευσης συμβάντων που αναπτύχθηκε για τις μιτοχονδριακές συστολές θα μπορούσε να αναγνωρίσει τα τελικά στάδια της βακτηριακής διαίρεσης χωρίς πρόσθετη εκπαίδευση – πιθανότατα λόγω ομοιοτήτων στο σχήμα συστολής και της παρουσίας ενός λειτουργικά παρόμοιου μοριακού δείκτη.
Η βελτιωμένη τεχνική μικροσκοπίας βλέπει ζωντανά κύτταρα με επτά φορές μεγαλύτερη ευαισθησία
Και πάλι, το EDA μείωσε τη φωτολεύκανση σε σύγκριση με τη σταθερή γρήγορη απεικόνιση και μέτρησε τις συστολές με σημαντικά μικρότερες μέσες διαμέτρους από ό,τι με σταθερή αργή απεικόνιση. Το EDA επέτρεψε την απεικόνιση ολόκληρου του κυτταρικού κύκλου και παρείχε λεπτομέρειες της βακτηριακής κυτταρικής διαίρεσης που είναι δύσκολο να αποτυπωθούν χρησιμοποιώντας σταθερή ταχύτητα απεικόνισης.
Λέει ο Manley Κόσμος Φυσικής ότι η ομάδα σχεδιάζει επίσης να εκπαιδεύσει νευρωνικά δίκτυα για να ανιχνεύει διαφορετικά είδη συμβάντων και να τα χρησιμοποιήσει για να προκαλέσει διαφορετικές αποκρίσεις υλικού. «Για παράδειγμα, οραματιζόμαστε την αξιοποίηση οπτογενετικών διαταραχών για τη ρύθμιση της μεταγραφής σε βασικές στιγμές της διαφοροποίησης των κυττάρων», εξηγεί. «Σκεφτόμαστε επίσης να χρησιμοποιήσουμε την ανίχνευση συμβάντων ως μέσο συμπίεσης δεδομένων, επιλέγοντας για αποθήκευση ή ανάλυση τα κομμάτια δεδομένων που είναι πιο σχετικά με μια δεδομένη μελέτη».
- Για να μπορέσουν οι ερευνητές να εφαρμόσουν το EDA σε μια μεγάλη ποικιλία μικροσκοπίων, η ομάδα παρέχει το πλαίσιο ελέγχου ως πρόσθετο ανοιχτού κώδικα για το λογισμικό Micro-Manager.
