La microscopía de fluorescencia de células vivas proporciona una herramienta indispensable para estudiar la dinámica de los sistemas biológicos. Pero muchos procesos biológicos, como la división celular bacteriana y la división mitocondrial, por ejemplo, ocurren esporádicamente, lo que dificulta su captura.
La captura continua de imágenes de una muestra a una velocidad de fotogramas alta garantizaría que, cuando se produzcan tales divisiones, se registren definitivamente. Pero el exceso de imágenes de fluorescencia provoca el fotoblanqueo y puede destruir prematuramente las muestras vivas. Mientras tanto, una velocidad de fotogramas más lenta corre el riesgo de perder eventos de interés. Lo que se necesita es una forma de predecir cuándo va a ocurrir un evento y luego instruir al microscopio para que comience a generar imágenes de alta velocidad.
Investigadores del Instituto Federal Suizo de Tecnología de Lausana (EPFL) han creado tal sistema. El equipo desarrolló un marco de adquisición impulsada por eventos (EDA) que automatiza el control del microscopio para obtener imágenes de eventos biológicos en detalle y limita el estrés en la muestra. Usando redes neuronales para detectar precursores sutiles de eventos de interés, EDA adapta los parámetros de adquisición, como la velocidad de la imagen o la duración de la medición, en respuesta.
“Un microscopio inteligente es como un auto sin conductor. Necesita procesar ciertos tipos de información, patrones sutiles a los que luego responde cambiando su comportamiento”, explica el investigador principal. suliana manley en un comunicado de prensa. "Al usar una red neuronal, podemos detectar eventos mucho más sutiles y usarlos para impulsar cambios en la velocidad de adquisición".
El marco EDA, descrito en Nature Methods, consiste en un circuito de retroalimentación entre un flujo de imágenes en vivo y los controles del microscopio. Los investigadores utilizaron el software Micro-Manager para capturar imágenes del microscopio y una red neuronal entrenada en datos etiquetados para analizarlos. Para cada imagen, la salida de la red actúa como un parámetro de toma de decisiones para alternar entre imágenes lentas y rápidas.
Reconocimiento de eventos
Para demostrar su nueva técnica, Manley y sus colegas integraron EDA en un microscopio de iluminación estructurada instantánea y lo usaron para capturar películas de lapso de tiempo súper resueltas de divisiones mitocondriales y bacterianas.
La división mitocondrial es impredecible, generalmente ocurre una vez cada pocos minutos y dura decenas de segundos. Para predecir el inicio de la división, el equipo entrenó la red neuronal para detectar constricciones, un cambio en la forma mitocondrial que conduce a la división, combinado con la presencia de una proteína llamada DRP1 que se requiere para las divisiones espontáneas.
La red neuronal genera un mapa de calor de "puntuaciones de eventos", con valores más altos (cuando tanto las constricciones como los niveles de DRP1 son altos) que indican ubicaciones dentro de la imagen donde es más probable que ocurra una división. Una vez que la puntuación del evento supera un valor de umbral, la velocidad de generación de imágenes aumenta para capturar los eventos de división en detalle. Una vez que la puntuación se reduce a un segundo umbral, el microscopio cambia a imágenes de baja velocidad para evitar exponer la muestra a una luz excesiva.
Los investigadores realizaron EDA en células que expresaban etiquetas fluorescentes dirigidas a mitocondrias. Durante cada medición de EDA, la red reconoció los precursores de la división bacteriana nueve veces en promedio. Esto cambió la velocidad de la imagen de lenta (0.2 cuadros/s) a rápida (3.8 cuadros/s) durante un promedio de 10 s, lo que resultó en una imagen rápida para el 18 % de los cuadros. Señalan que muchos sitios acumularon DRP1 pero no llevaron a la división. Estos sitios no activaron la red, lo que demuestra su capacidad para discriminar eventos de interés.
A modo de comparación, el equipo también recopiló imágenes a velocidades lentas y rápidas constantes. EDA causó menos fotoblanqueo de muestras que las imágenes rápidas de tasa fija, lo que permitió observaciones más largas de cada muestra y aumentó las probabilidades de capturar eventos raros de división mitocondrial. En algunos casos, la muestra se recuperó del fotoblanqueo durante las fases de obtención de imágenes lentas, lo que permitió una mayor dosis de luz acumulada.
Si bien el blanqueamiento fue mayor con EDA que con imágenes lentas constantes, muchas sesiones de EDA alcanzaron los 10 minutos sin degradación de la salud de la muestra. Los investigadores también encontraron que EDA resolvió mejor las constricciones que preceden a la división, así como la progresión de los estados de la membrana que conducen a la fisión, según lo capturado por las ráfagas de imágenes rápidas.
“El potencial de la microscopía inteligente incluye medir qué se perdería en las adquisiciones estándar”, explica Manley. “Capturamos más eventos, medimos constricciones más pequeñas y podemos seguir cada división con mayor detalle”.
Detección de la división bacteriana
Luego, los investigadores usaron EDA para estudiar la división celular en las bacterias. C. creciente. El ciclo celular bacteriano ocurre en la escala de tiempo de decenas de minutos, lo que crea distintos desafíos para la microscopía de células vivas. Recogieron datos a una velocidad de imagen lenta de 6.7 cuadros por hora, una velocidad de imagen rápida de 20 cuadros por hora o una velocidad variable conmutada por EDA.
El equipo descubrió que la red de detección de eventos desarrollada para las constricciones mitocondriales podía reconocer las etapas finales de la división bacteriana sin capacitación adicional, probablemente debido a las similitudes en la forma de la constricción y la presencia de un marcador molecular funcionalmente similar.
La técnica de microscopía mejorada ve células vivas con siete veces más sensibilidad
Una vez más, EDA redujo el fotoblanqueo en comparación con las imágenes rápidas constantes y midió las constricciones con diámetros promedio significativamente más pequeños que con las imágenes lentas constantes. EDA permitió obtener imágenes de todo el ciclo celular y proporcionó detalles de la división celular bacteriana que son difíciles de capturar utilizando una velocidad de imagen fija.
manley dice Mundo de la física que el equipo también planea entrenar redes neuronales para detectar diferentes tipos de eventos y usarlos para evocar diferentes respuestas de hardware. “Por ejemplo, imaginamos aprovechar las perturbaciones optogenéticas para modular la transcripción en momentos clave de la diferenciación celular”, explica. “También pensamos en usar la detección de eventos como un medio de compresión de datos, seleccionando para almacenar o analizar los datos que son más relevantes para un estudio determinado”.
- Para permitir a los investigadores implementar EDA en una amplia variedad de microscopios, el equipo proporciona el marco de control como un complemento de código abierto para el software Micro-Manager.
