Elusrakkude fluorestsentsmikroskoopia on asendamatu vahend bioloogiliste süsteemide dünaamika uurimiseks. Kuid paljud bioloogilised protsessid – näiteks bakterirakkude jagunemine ja mitokondriaalne jagunemine – toimuvad juhuslikult, mistõttu on nende tabamine keeruline.
Proovi pidev pildistamine suure kaadrisagedusega tagaks, et kui sellised jagunemised tekivad, siis need kindlasti salvestatakse. Kuid liigne fluorestsentskujutis põhjustab fotopleegitamist ja võib elusproovid enneaegselt hävitada. Aeglasem kaadrisagedus võib aga huvipakkuvatest sündmustest ilma jääda. Vaja on viisi, kuidas ennustada, millal sündmus juhtuma hakkab, ja seejärel anda mikroskoobile käsk alustada kiiret pildistamist.
Šveitsi Föderaalse Tehnoloogiainstituudi Lausanne'i teadlased (EPFL) on just sellise süsteemi loonud. Meeskond töötas välja sündmustepõhise omandamise (EDA) raamistiku, mis automatiseerib mikroskoobi juhtimist bioloogiliste sündmuste üksikasjalikuks pildistamiseks, piirates samal ajal proovi stressi. Kasutades närvivõrke huvipakkuvate sündmuste peente lähteainete tuvastamiseks, kohandab EDA vastuseks hankimisparameetreid, nagu pildistamise kiirus või mõõtmise kestus.
"Intelligentne mikroskoop sarnaneb isejuhtiva autoga. Ta peab töötlema teatud tüüpi teavet, peeneid mustreid, millele ta seejärel reageerib, muutes oma käitumist, ”selgitab juhtivuurija. Suliana Manley pressiteates. "Närvivõrku kasutades saame tuvastada palju peenemaid sündmusi ja kasutada neid omandamise kiiruse muutmiseks."
EDA raamistik, mida on kirjeldatud artiklis Loodusmeetodid, koosneb otsepildivoo ja mikroskoobi juhtnuppude vahelisest tagasisideahelast. Uurijad kasutasid mikroskoobist kujutiste jäädvustamiseks tarkvara Micro-Manager ja nende analüüsimiseks märgistatud andmetele koolitatud närvivõrku. Iga pildi puhul toimib võrguväljund aeglase ja kiire pildistamise vahel lülitumiseks otsustusparameetrina.
Sündmuse äratundmine
Oma uue tehnika demonstreerimiseks integreerisid Manley ja kolleegid EDA kohesesse struktureeritud valgustusmikroskoobi ja kasutasid seda ülilahutusega aeglustatud filmide jäädvustamiseks mitokondrite ja bakterite jagunemistest.
Mitokondriaalne jagunemine on ettearvamatu, tavaliselt toimub iga paari minuti järel ja kestab kümneid sekundeid. Jagunemise alguse ennustamiseks treenis meeskond närvivõrku, et tuvastada kitsendused, mitokondriaalse kuju muutus, mis viib jagunemiseni, koos valgu DRP1 olemasoluga, mis on vajalik spontaanseks jagunemiseks.
Närvivõrk väljastab "sündmuste skooride" soojuskaardi, millel on kõrgemad väärtused (kui nii kitsendused kui ka DRP1 tasemed on kõrged), mis näitavad pildil kohti, kus jagunemine on tõenäolisem. Kui sündmuse skoor ületab läviväärtuse, suureneb pildistamise kiirus, et jagamise sündmused üksikasjalikult jäädvustada. Kui skoor väheneb teise läveni, lülitub mikroskoop väikese kiirusega pildistamisele, et vältida proovi kokkupuudet liigse valgusega.
Teadlased viisid läbi EDA rakkudele, mis ekspresseerivad mitokondritele suunatud fluorestseeruvaid märgiseid. Iga EDA mõõtmise ajal tuvastas võrk bakterite jagunemise prekursoreid keskmiselt üheksa korda. See lülitas pildistamise kiiruse aeglasest (0.2 kaadrit/s) kiireks (3.8 kaadrit/s) keskmiselt 10 sekundiks, mille tulemuseks oli kiire pildistamine 18% kaadrite puhul. Nad märgivad, et paljud saidid kogusid DRP1, kuid ei viinud jagunemiseni. Need saidid ei käivitanud võrku, näidates selle võimet huvipakkuvaid sündmusi diskrimineerida.
Võrdluseks kogus meeskond pilte ka pideva aeglase ja kiire kiirusega. EDA põhjustas vähem proovide fotopleegitamist kui fikseeritud kiirusega kiire pildistamine, võimaldades iga proovi pikemat vaatlust ja suurendades haruldaste mitokondriaalse jagunemise sündmuste jäädvustamist. Mõnel juhul taastus proov aeglase pildistamise faasis fotovalgendusest, võimaldades suuremat kumulatiivset valgusdoosi.
Kuigi pleegitamine oli EDA korral suurem kui pideva aeglase pildistamise korral, jõudsid paljud EDA seansid 10 minutini ilma proovi tervist halvendamata. Uurijad leidsid ka, et EDA lahendas paremini jagunemisele eelnenud kitsendused, samuti lõhustumiseni viivate membraaniseisundite progresseerumise, mis on jäädvustatud kiirete piltide purunemisega.
"Intelligentse mikroskoopia potentsiaal hõlmab mõõtmist, millised standardsed omandamised puuduksid," selgitab Manley. "Jäädvustame rohkem sündmusi, mõõdame väiksemaid kitsendusi ja saame iga jaotust üksikasjalikumalt jälgida."
Bakterite jagunemise tuvastamine
Järgmisena kasutasid teadlased EDA-d bakterite rakkude jagunemise uurimiseks C. crescentus. Bakterirakutsükkel toimub kümnete minutite jooksul, tekitades elusrakkude mikroskoopia jaoks selgeid väljakutseid. Nad kogusid andmeid aeglase pildistamiskiirusega 6.7 kaadrit tunnis, kiire pildistamiskiirusega 20 kaadrit tunnis või EDA poolt vahetatava muutuva kiirusega.
Meeskond leidis, et mitokondriaalsete kitsenduste jaoks välja töötatud sündmuste tuvastamise võrk suudab tuvastada bakterite jagunemise viimased etapid ilma täiendava koolituseta – tõenäoliselt ahenemise kuju sarnasuste ja funktsionaalselt sarnase molekulaarse markeri olemasolu tõttu.
Täiustatud mikroskoopiatehnika näeb elusrakke seitse korda suurema tundlikkusega
Jällegi vähendas EDA fotopleegitamist võrreldes pideva kiire pildistamisega ja mõõdeti kitsendusi oluliselt väiksema keskmise läbimõõduga kui pideva aeglase pildistamise korral. EDA võimaldas pildistada kogu rakutsüklit ja andis üksikasju bakterirakkude jagunemise kohta, mida on fikseeritud pildistamiskiiruse abil raske tabada.
Manley räägib Füüsika maailm et meeskond kavatseb ka koolitada närvivõrke, et tuvastada erinevat tüüpi sündmusi ja kasutada neid erinevate riistvarareaktsioonide esilekutsumiseks. "Näiteks näeme ette optogeneetiliste häirete rakendamist, et moduleerida transkriptsiooni rakkude diferentseerumise võtmehetkedel, " selgitab ta. "Mõtleme ka sündmuste tuvastamise kasutamist andmete tihendamise vahendina, valides salvestamiseks või analüüsimiseks konkreetse uuringu jaoks kõige asjakohasemad andmed."
- Et võimaldada teadlastel rakendada EDA-d mitmesugustes mikroskoopides, pakub meeskond juhtimisraamistikku avatud lähtekoodiga pistikprogramm tarkvara Micro-Manager jaoks.
