Laajennusmikroskopia mahdollistaa nanokuvauksen tavanomaisella mikroskoopilla

Laajennusmikroskopia on biologinen kuvantamistekniikka, joka mahdollistaa nanomittakaavan kuvantamisen käyttämällä perinteistä diffraktiorajoitettua fluoresenssimikroskooppia. Se toimii upottamalla näytteitä vedessä turpoavaan hydrogeeliin ja laajentamalla sitten geeliä. Tämä laajentaa fyysisesti biomolekyylejä poispäin toisistaan, mikä mahdollistaa niiden kyselyn resoluutiolla, joka aiemmin oli saavutettavissa vain kalliilla korkearesoluutioisilla kuvantamistekniikoilla.

Nykyisiä laajennusmikroskopiaprotokollat ​​eivät kuitenkaan ole optimoituja laajamittaista käyttöönottoa varten. Näytteet on käsiteltävä räätälöityillä ankkurointiaineilla tiettyjen biomolekyylien ja etikettien yhdistämiseksi hydrogeeliin. Lisäksi useimmat lähestymistavat ovat saavuttaneet vain suunnilleen nelinkertaisen kudoksen laajenemisen, mikä rajoittaa tehokkaan resoluution noin 70 nm:iin tavanomaisessa optisessa mikroskoopissa, jossa on 280 nm:n diffraktiorajoitettu objektiivilinssi.

Näiden puutteiden voittamiseksi ryhmä lähti liikkeelle Carnegie Mellon University on kehittänyt uuden laajennusmikroskooppistrategian nimeltä Magnify. Protokolla, joka on kuvattu kohdassa Nature Biotechnology, käyttää uutta mekaanisesti tukevaa hydrogeeliä, joka säilyttää joukon biomolekyylejä ilman erillistä ankkurointivaihetta.

Magnify voi laajentaa näytteitä jopa 11-kertaiseksi, mikä mahdollistaa solujen ja kudosten kuvantamisen noin 25 nm:n tehokkaalla resoluutiolla tavanomaisella mikroskoopilla. Yhdistettynä superresoluutioon optiseen fluktuaatiokuvaukseen (SOFI, laskennallinen jälkikäsittelymenetelmä), se saavutti tehokkaan noin 15 nm:n resoluution.

Aiemmat laajennusmikroskooppiprotokollat ​​vaativat myös monien kudoksia koossa pitävien biomolekyylien poistamista. "Jotta solut todella laajenevat, sinun on käytettävä entsyymejä proteiinien sulattamiseen, joten loppujen lopuksi sinulla oli tyhjä geeli, jonka etiketit osoittavat kiinnostavan proteiinin sijainnin", selittää vanhempi tutkija. Yongxin Zhao lehdistötiedotteessa.

”Yksi Magnifyn tärkeimmistä myyntivalteista on universaali strategia pitää kudoksen biomolekyylit, mukaan lukien proteiinit, nukleiinihapot ja hiilihydraatit, laajennetussa näytteessä. Molekyylit pidetään ehjinä, ja usean tyyppisiä biomolekyylejä voidaan leimata yhdessä näytteessä”, Zhao lisää.

Laajat sovellukset

Zhao ja kollegat käyttivät Magnifya monenlaisiin kudostyyppeihin. Esimerkiksi 11-kertaisesti laajennetun hiiren aivoosion, joka oli värjätty proteiinin kokonaispitoisuuden perusteella, kuvantaminen mahdollisti aivojen yksittäisten synapsien nanoskooppisen arkkitehtuurin visualisoinnin. Magnify osoitti tehokkaan noin 18 nm:n erotuskyvyn käyttämällä ×60 objektiivilinssiä (noin 200 nm diffraktioraja).

Tutkijat vahvistivat Magnify-protokollalla saadun pienen vääristymän useissa kudostyypeissä käyttämällä SOFI-esilaajennusta ja konfokaalimikroskopiaa laajennuksen jälkeen. He eivät löytäneet merkittäviä morfologisia muutoksia soluytimien ja proteiinimarkkerien laajenemista edeltävien ja jälkeisten kuvien välillä makroskooppisella tai subdiffraktiotasolla.

Tiimi testasi myös Magnifya useilla formaliinilla kiinnitetyillä parafiiniin upotetuilla näytteillä – jotka ovat tärkeimpiä biopsiavalmisteita, mutta joita on haastavaa laajentaa nykyisillä protokollilla. Tämä sisälsi kudosleikkeitä munuaisista, rinnasta, aivoista ja paksusuolesta sekä vastaavista kasvaimista. Magnify voisi laajentaa näytteitä noin 8.00–10.77 kertoimilla vedessä kudostyypistä riippuen.

Yksi tärkeimmistä tavoitteista oli tehdä Magnifysta soveltuva laajalle valikoimalle kudosnäytteitä, mikä helpotti tutkijoiden ottamista käyttöön uutta protokollaa varten. "Se toimii eri kudostyyppien, kiinnitysmenetelmien ja jopa säilötyn ja varastoidun kudoksen kanssa", sanoo toinen kirjoittaja Brendan Gallagher. ”Se on erittäin joustava siinä mielessä, että sinun ei välttämättä tarvitse suunnitella kokeita uudelleen Magnifyta silmällä pitäen; se toimii sen kanssa, mitä sinulla jo on."

Resoluution lisääminen

Havainnollistaakseen tehokkaan resoluution lisääntymistä, jonka Magnifyn ja SOFI:n yhdistäminen mahdollisti, tutkijat käyttivät yhdistelmää kuvaamaan ihmisen keuhkojen organoideja, erityisesti värejä, jotka puhdistavat limaa hengitysteistä. Halkaisijaltaan 200 nm ja vain muutaman mikrometrin pituisina nämä rakenteet ovat yleensä liian pieniä nähdäkseen ilman elektronimikroskopian (EM) kaltaista tekniikkaa.

Magnify – SOFI pystyi täysin ratkaisemaan värekarvojen ja tyvikappaleiden onton rakenteen, mukaan lukien ulkorengas, jonka EM on aiemmin osoittanut käsittävän yhdeksän mikrotubuluskimppua. Tutkijat arvioivat tehokkaaksi resoluutioksi noin 14–17 nm (käyttämällä 280 nm:n diffraktiorajoitettua objektiivilinssiä). He pystyivät myös visualisoimaan keuhkojen vikoja keuhkosoluissa, joissa oli geneettisiä mutaatioita.

Superresoluutioinen mikroskopia paljastaa koronavirusta replikoivan koneiston

"Uusimpien Magnify-tekniikoiden avulla voimme laajentaa keuhkokudoksia ja alkaa nähdä liikkuvien värien ultrarakennetta jopa tavallisella mikroskoopilla, mikä nopeuttaa sekä perus- että kliinisiä tutkimuksia", kommentoi toinen kirjoittaja. Xi Ren.

Magnifyn onnistuneen kehityksen pohjalta tiimi käyttää sitä nyt entistä monimutkaisempien kudosnäytteiden tutkimiseen. "Tämä sisältää tartunnan saaneiden kudosten sekä suurempien yksilöiden, kuten kokonaisten elinten, tutkimisen", Zhao kertoo Fysiikan maailma. "Lisäksi pyrimme optimoimaan Magnifyn patologisten ihmisnäytteiden tutkimiseen ja aivojen nanomittakaavan muutosten tutkimiseen oppimisprosessien ja sairauksien aikana. Näiden läpimurtojen myötä tältä erittäin lupaavalta tutkimusalalta voidaan odottaa lisää löytöjä."

• SEO-pohjainen sisällön ja PR-jakelu. Vahvista jo tänään.
• Platoblockchain. Web3 Metaverse Intelligence. Tietoa laajennettu. Pääsy tästä.
• Lähde: https://physicsworld.com/a/expansion-microscopy-enables-nanoimaging-with-a-conventional-microscope/