Elävien solujen fluoresenssimikroskopia on välttämätön työkalu biologisten järjestelmien dynamiikan tutkimiseen. Mutta monet biologiset prosessit – kuten esimerkiksi bakteerisolujen jakautuminen ja mitokondrioiden jakautuminen – tapahtuvat satunnaisesti, mikä tekee niistä haastavan siepata.
Näytteen jatkuva kuvantaminen suurella kuvanopeudella varmistaisi, että kun tällaisia jakoja tapahtuu, ne ehdottomasti tallennetaan. Mutta liiallinen fluoresenssikuvaus aiheuttaa valovalkaisua ja voi tuhota eläviä näytteitä ennenaikaisesti. Hitaampi kuvanopeus puolestaan vaarantaa kiinnostavien tapahtumien puuttumisen. Tarvitaan tapa ennustaa, milloin tapahtuma on tapahtumassa, ja sitten ohjeistaa mikroskooppia aloittamaan nopea kuvantaminen.
Sveitsin liittovaltion teknologiainstituutin Lausannen tutkijat (EPFL) ovat luoneet juuri tällaisen järjestelmän. Tiimi kehitti tapahtumalähtöisen hankinnan (EDA) kehyksen, joka automatisoi mikroskoopin ohjauksen kuvaamaan biologisia tapahtumia yksityiskohtaisesti ja rajoittaen samalla näytteeseen kohdistuvaa stressiä. Käyttämällä hermoverkkoja havaitsemaan kiinnostavien tapahtumien hienovaraisia esiasteita, EDA mukauttaa tiedonkeruuparametreja – kuten kuvantamisnopeutta tai mittauksen kestoa – vastauksena.
”Älykäs mikroskooppi on tavallaan kuin itseajava auto. Sen täytyy käsitellä tietyntyyppistä tietoa, hienovaraisia malleja, joihin se sitten reagoi muuttamalla käyttäytymistään", kertoo johtava tutkija. Suliana Manley lehdistötiedotteessa. "Käyttämällä hermoverkkoa voimme havaita paljon hienovaraisempia tapahtumia ja käyttää niitä saamaan aikaan muutoksia hankintanopeudessa."
EDA-kehys, joka on kuvattu kohdassa Luontomenetelmät, koostuu suoran kuvavirran ja mikroskoopin säätimien välisestä takaisinkytkentäsilmukasta. Tutkijat käyttivät Micro-Manager-ohjelmistoa ottamaan kuvia mikroskoopista ja hermoverkkoa, joka oli koulutettu merkittyihin tietoihin analysoimaan niitä. Jokaisen kuvan verkkolähtö toimii päätöksentekoparametrina, jolla vaihdetaan hitaan ja nopean kuvantamisen välillä.
Tapahtuman tunnistaminen
Esitelläkseen uutta tekniikkaansa Manley ja kollegat integroivat EDA:n välittömään rakenteelliseen valaistusmikroskooppiin ja käyttivät sitä tallentaakseen superresoluutioisia time-lapse-elokuvia mitokondrioiden ja bakteerien jakautumisesta.
Mitokondrioiden jakautuminen on arvaamatonta, tyypillisesti sitä tapahtuu muutaman minuutin välein ja kestää kymmeniä sekunteja. Ennustaakseen jakautumisen alkamista ryhmä koulutti hermoverkkoa havaitsemaan supistukset, mitokondrioiden muodon muutoksen, joka johtaa jakautumiseen, yhdistettynä spontaaneihin jakautumiseen tarvittavan DRP1-nimisen proteiinin läsnäoloon.
Neuraaliverkko tuottaa lämpökartan "tapahtumapisteistä", joissa korkeammat arvot (kun sekä supistukset että DRP1-tasot ovat korkeat) osoittavat kuvan paikat, joissa jakautuminen todennäköisimmin tapahtuu. Kun tapahtuman pistemäärä ylittää kynnysarvon, kuvantamisnopeus kasvaa jakotapahtumat kaapatakseen yksityiskohtaisesti. Kun pisteet pienenevät toiseen kynnykseen, mikroskooppi siirtyy alhaisen nopeuden kuvaamiseen, jotta näytettä ei altistu liialliselle valolle.
Tutkijat suorittivat EDA:n soluille, jotka ekspressoivat mitokondrioihin kohdistettuja fluoresoivia leimoja. Jokaisen EDA-mittauksen aikana verkko tunnisti bakteerien jakautumisen prekursoreita keskimäärin yhdeksän kertaa. Tämä vaihtoi kuvantamisnopeuden hitaasta (0.2 kuvaa/s) nopeaan (3.8 kuvaa/s) keskimäärin 10 sekunniksi, mikä johti nopeaan kuvaamiseen 18 %:lla kuvista. He huomauttavat, että monille sivustoille kertyi DRP1, mutta ne eivät johtaneet jakautumiseen. Nämä sivustot eivät käynnistäneet verkkoa, mikä osoitti sen kyvyn syrjiä kiinnostavia tapahtumia.
Vertailun vuoksi tiimi keräsi myös kuvia tasaisella hitaalla ja nopealla nopeudella. EDA aiheutti vähemmän näytteen valovalkaisua kuin kiinteänopeuksinen nopea kuvantaminen, mikä mahdollisti pidempiä havaintoja jokaisesta näytteestä ja lisäsi harvinaisten mitokondrioiden jakautumistapahtumien tallentamisen todennäköisyyttä. Joissakin tapauksissa näyte toipui valovalkaisusta hitaiden kuvausvaiheiden aikana, mikä mahdollisti suuremman kumulatiivisen valoannoksen.
Vaikka valkaisu oli korkeampaa EDA:lla kuin jatkuvassa hitaassa kuvantamisessa, monet EDA-istunnot saavuttivat 10 minuuttia ilman, että näytteen kunto heikkeni. Tutkijat havaitsivat myös, että EDA ratkaisi paremmin jakautumista edeltävät supistukset sekä fissioon johtaneiden kalvotilojen etenemisen nopeiden kuvien purskeiden vangitsemana.
"Älykkään mikroskopian potentiaaliin kuuluu sen mittaaminen, mitä standardihankinnoissa jäisi paitsi", Manley selittää. "Tallennamme enemmän tapahtumia, mittaamme pienempiä rajoituksia ja voimme seurata jokaista jakoa tarkemmin."
Bakteerien jakautumisen havaitseminen
Seuraavaksi tutkijat käyttivät EDA:ta tutkiakseen solujen jakautumista bakteereissa C. crescentus. Bakteerisolusykli tapahtuu kymmenien minuuttien ajan, mikä luo selviä haasteita elävien solujen mikroskopialle. He keräsivät dataa hitaalla kuvantamisnopeudella 6.7 kuvaa/h, nopealla 20 ruutua/h kuvantamisnopeudella tai EDA:n kytkemällä muuttuvalla nopeudella.
Ryhmä havaitsi, että mitokondrioiden supistumista varten kehitetty tapahtumantunnistusverkko pystyi tunnistamaan bakteerien jakautumisen viimeiset vaiheet ilman lisäkoulutusta – todennäköisesti johtuen supistumisen muodon samankaltaisuuksista ja toiminnallisesti samanlaisen molekyylimarkkerin läsnäolosta.
Parannettu mikroskopiatekniikka näkee elävät solut seitsemän kertaa herkemmin
Jälleen EDA vähensi valovalkaisua verrattuna jatkuvaan nopeaan kuvantamiseen ja mittasi supistuksia huomattavasti pienemmällä keskihalkaisijalla kuin jatkuvalla hitaalla kuvantamisella. EDA mahdollisti koko solusyklin kuvantamisen ja tarjosi yksityiskohtia bakteerisolujen jakautumisesta, joita on vaikea saada kiinni kiinteällä kuvantamisnopeudella.
Manley kertoo Fysiikan maailma että tiimi aikoo myös kouluttaa hermoverkkoja havaitsemaan erilaisia tapahtumia ja käyttämään niitä erilaisten laitteistoreaktioiden herättämiseen. "Esimerkiksi kuvittelemme optogeneettisten häiriöiden hyödyntämisen transkription moduloimiseksi solujen erilaistumisen avainhetkillä", hän selittää. "Ajattelemme myös tapahtumien havaitsemista keinona tietojen pakkaamiseen, jolloin valitaan tallennukseen tai analysointiin ne tiedot, jotka ovat tärkeimmät tietyn tutkimuksen kannalta."
- Jotta tutkijat voivat toteuttaa EDA:ta monenlaisissa mikroskoopeissa, tiimi tarjoaa ohjauskehyksen avoimen lähdekoodin laajennus Micro-Manager-ohjelmistolle.
