La microscopie à fluorescence des cellules vivantes constitue un outil indispensable pour étudier la dynamique des systèmes biologiques. Mais de nombreux processus biologiques - tels que la division cellulaire bactérienne et la division mitochondriale, par exemple - se produisent de manière sporadique, ce qui les rend difficiles à capturer.
L'imagerie continue d'un échantillon à une fréquence d'images élevée garantirait que lorsque de telles divisions se produisent, elles seront définitivement enregistrées. Mais une imagerie par fluorescence excessive provoque un photoblanchiment et peut détruire prématurément des échantillons vivants. Une fréquence d'images plus lente, quant à elle, risque de manquer des événements d'intérêt. Ce qu'il faut, c'est un moyen de prédire quand un événement est sur le point de se produire, puis de demander au microscope de commencer l'imagerie à grande vitesse.
Des chercheurs de l'Ecole polytechnique fédérale de Lausanne (EPFL) ont créé un tel système. L'équipe a développé un cadre d'acquisition pilotée par les événements (EDA) qui automatise le contrôle du microscope pour imager en détail les événements biologiques tout en limitant le stress sur l'échantillon. En utilisant des réseaux de neurones pour détecter les précurseurs subtils d'événements d'intérêt, l'EDA adapte les paramètres d'acquisition - tels que la vitesse d'imagerie ou la durée de mesure - en réponse.
« Un microscope intelligent est un peu comme une voiture autonome. Il doit traiter certains types d'informations, des schémas subtils auxquels il réagit ensuite en modifiant son comportement », explique le chercheur principal. Suliana Manley dans un communiqué de presse. "En utilisant un réseau de neurones, nous pouvons détecter des événements beaucoup plus subtils et les utiliser pour modifier la vitesse d'acquisition."
Le cadre EDA, décrit dans Nature Methods, consiste en une boucle de rétroaction entre un flux d'images en direct et les commandes du microscope. Les chercheurs ont utilisé le logiciel Micro-Manager pour capturer les images du microscope et un réseau neuronal formé sur des données étiquetées pour les analyser. Pour chaque image, la sortie du réseau agit comme un paramètre décisionnel pour basculer entre l'imagerie lente et rapide.
Reconnaissance d'événement
Pour démontrer leur nouvelle technique, Manley et ses collègues ont intégré l'EDA dans un microscope à éclairage structuré instantané et l'ont utilisé pour capturer des films accélérés super résolus de divisions mitochondriales et bactériennes.
La division mitochondriale est imprévisible, se produisant généralement une fois toutes les quelques minutes et durant des dizaines de secondes. Pour prédire le début de la division, l'équipe a formé le réseau neuronal pour détecter les constrictions, un changement de forme mitochondriale qui conduit à la division, combiné à la présence d'une protéine appelée DRP1 qui est nécessaire pour les divisions spontanées.
Le réseau de neurones produit une carte thermique des "scores d'événements", avec des valeurs plus élevées (lorsque les constrictions et les niveaux de DRP1 sont élevés) indiquant les emplacements dans l'image où la division est plus susceptible de se produire. Une fois que le score d'événement dépasse une valeur seuil, la vitesse d'imagerie augmente pour capturer les événements de division en détail. Une fois que le score est réduit à un deuxième seuil, le microscope passe à l'imagerie à basse vitesse pour éviter d'exposer l'échantillon à une lumière excessive.
Les chercheurs ont effectué une EDA sur des cellules exprimant des marqueurs fluorescents ciblés sur les mitochondries. Lors de chaque mesure d'EDA, le réseau a reconnu neuf fois en moyenne des précurseurs de la division bactérienne. Cela a fait basculer la vitesse d'imagerie de lente (0.2 images/s) à rapide (3.8 images/s) pendant une moyenne de 10 s, ce qui a entraîné une imagerie rapide pour 18 % des images. Ils notent que de nombreux sites ont accumulé DRP1 mais n'ont pas conduit à la division. Ces sites n'ont pas déclenché le réseau, démontrant sa capacité à discriminer les événements d'intérêt.
À titre de comparaison, l'équipe a également collecté des images à des vitesses lentes et rapides constantes. L'EDA a provoqué moins de photoblanchiment des échantillons que l'imagerie rapide à taux fixe, permettant des observations plus longues de chaque échantillon et augmentant les chances de capturer des événements rares de division mitochondriale. Dans certains cas, l'échantillon a récupéré du photoblanchiment pendant les phases d'imagerie lente, permettant une dose de lumière cumulée plus élevée.
Alors que le blanchiment était plus élevé avec l'EDA que pour l'imagerie lente constante, de nombreuses séances d'EDA ont atteint 10 minutes sans dégradation de la santé de l'échantillon. Les chercheurs ont également découvert que l'EDA résolvait mieux les constrictions précédant la division, ainsi que la progression des états membranaires conduisant à la fission, comme capturé par les rafales d'images rapides.
"Le potentiel de la microscopie intelligente comprend la mesure de ce que les acquisitions standard manqueraient", explique Manley. "Nous capturons plus d'événements, mesurons des constrictions plus petites et pouvons suivre chaque division plus en détail."
Détecter la division bactérienne
Ensuite, les chercheurs ont utilisé l'EDA pour étudier la division cellulaire chez les bactéries C. croissant. Le cycle cellulaire bactérien se produit sur l'échelle de temps de dizaines de minutes, créant des défis distincts pour la microscopie de cellules vivantes. Ils ont collecté des données à une vitesse d'imagerie lente de 6.7 images/h, une vitesse d'imagerie rapide de 20 images/h ou une vitesse variable commutée par EDA.
L'équipe a découvert que le réseau de détection d'événements développé pour les constrictions mitochondriales pouvait reconnaître les dernières étapes de la division bactérienne sans formation supplémentaire - probablement en raison de similitudes dans la forme de la constriction et de la présence d'un marqueur moléculaire fonctionnellement similaire.
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Encore une fois, l'EDA a réduit le photoblanchiment par rapport à l'imagerie rapide constante et a mesuré les constrictions avec des diamètres moyens significativement plus petits qu'avec l'imagerie lente constante. L'EDA a permis l'imagerie de l'ensemble du cycle cellulaire et a fourni des détails sur la division cellulaire bactérienne qui sont difficiles à capturer à l'aide d'une vitesse d'imagerie fixe.
Manley raconte Monde de la physique que l'équipe prévoit également de former des réseaux de neurones pour détecter différents types d'événements et les utiliser pour évoquer différentes réponses matérielles. « Par exemple, nous envisageons d'exploiter les perturbations optogénétiques pour moduler la transcription à des moments clés de la différenciation cellulaire », explique-t-elle. "Nous pensons également à utiliser la détection d'événements comme moyen de compression des données, en sélectionnant pour le stockage ou l'analyse les éléments de données les plus pertinents pour une étude donnée."
- Pour permettre aux chercheurs de mettre en œuvre l'EDA sur une grande variété de microscopes, l'équipe fournit le cadre de contrôle en tant que plug-in open source pour le logiciel Micro-Manager.
