जीवित कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी जैविक प्रणालियों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण प्रदान करती है। लेकिन कई जैविक प्रक्रियाएं - जैसे कि जीवाणु कोशिका विभाजन और माइटोकॉन्ड्रियल विभाजन, उदाहरण के लिए - छिटपुट रूप से होती हैं, जिससे उन्हें पकड़ना चुनौतीपूर्ण हो जाता है।
उच्च फ्रेम दर पर एक नमूने की लगातार इमेजिंग यह सुनिश्चित करेगी कि जब ऐसे विभाजन होंगे, तो वे निश्चित रूप से रिकॉर्ड किए जाएंगे। लेकिन अत्यधिक प्रतिदीप्ति इमेजिंग फोटोब्लीचिंग का कारण बनती है और जीवित नमूनों को समय से पहले नष्ट कर सकती है। इस बीच, धीमी फ्रेम दर, रुचि की घटनाओं के छूटने का जोखिम उठाती है। जरूरत इस बात की है कि किसी घटना के घटित होने की भविष्यवाणी की जाए और फिर माइक्रोस्कोप को हाई-स्पीड इमेजिंग शुरू करने का निर्देश दिया जाए।
स्विस फेडरल इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी लॉज़ेन के शोधकर्ता (EPFL) ने एक ऐसी ही व्यवस्था बनाई है। टीम ने एक घटना-संचालित अधिग्रहण (ईडीए) ढांचा विकसित किया जो नमूने पर तनाव को सीमित करते हुए जैविक घटनाओं की विस्तृत छवि के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण को स्वचालित करता है। रुचि की घटनाओं के सूक्ष्म पूर्ववर्तियों का पता लगाने के लिए तंत्रिका नेटवर्क का उपयोग करते हुए, ईडीए प्रतिक्रिया में अधिग्रहण मापदंडों - जैसे इमेजिंग गति या माप अवधि - को अनुकूलित करता है।
“एक बुद्धिमान माइक्रोस्कोप एक स्व-चालित कार की तरह है। इसे कुछ प्रकार की जानकारी, सूक्ष्म पैटर्न को संसाधित करने की आवश्यकता होती है, जिसके बाद यह अपने व्यवहार को बदलकर प्रतिक्रिया करता है, ”प्रमुख अन्वेषक बताते हैं सुलियाना मैनली एक प्रेस बयान में. "एक तंत्रिका नेटवर्क का उपयोग करके, हम बहुत अधिक सूक्ष्म घटनाओं का पता लगा सकते हैं और अधिग्रहण की गति में बदलाव लाने के लिए उनका उपयोग कर सकते हैं।"
ईडीए रूपरेखा, में वर्णित है प्रकृति के तरीके, एक लाइव इमेज स्ट्रीम और माइक्रोस्कोप नियंत्रण के बीच एक फीडबैक लूप होता है। शोधकर्ताओं ने माइक्रोस्कोप से छवियों को कैप्चर करने के लिए माइक्रो-मैनेजर सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया और उनका विश्लेषण करने के लिए लेबल किए गए डेटा पर प्रशिक्षित एक तंत्रिका नेटवर्क का उपयोग किया। प्रत्येक छवि के लिए, नेटवर्क आउटपुट धीमी और तेज़ इमेजिंग के बीच टॉगल करने के लिए निर्णय लेने वाले पैरामीटर के रूप में कार्य करता है।
घटना की पहचान
अपनी नई तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए, मैनली और सहकर्मियों ने ईडीए को एक त्वरित संरचित रोशनी माइक्रोस्कोप में एकीकृत किया और इसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल और बैक्टीरियल डिवीजनों की सुपर-रिज़ॉल्यूशन टाइम-लैप्स फिल्मों को कैप्चर करने के लिए किया।
माइटोकॉन्ड्रियल विभाजन अप्रत्याशित है, आमतौर पर हर कुछ मिनटों में एक बार होता है और दसियों सेकंड तक चलता है। विभाजन की शुरुआत की भविष्यवाणी करने के लिए, टीम ने तंत्रिका नेटवर्क को संकुचन का पता लगाने के लिए प्रशिक्षित किया, माइटोकॉन्ड्रियल आकार में परिवर्तन जो विभाजन की ओर ले जाता है, जो डीआरपी1 नामक प्रोटीन की उपस्थिति के साथ संयुक्त होता है जो सहज विभाजन के लिए आवश्यक है।
तंत्रिका नेटवर्क उच्च मूल्यों के साथ "इवेंट स्कोर" का हीट मैप आउटपुट करता है (जब संकुचन और डीआरपी1 स्तर दोनों उच्च होते हैं) जो छवि के भीतर उन स्थानों को इंगित करता है जहां विभाजन होने की अधिक संभावना है। एक बार जब इवेंट स्कोर एक सीमा मान से अधिक हो जाता है, तो विभाजन की घटनाओं को विस्तार से पकड़ने के लिए इमेजिंग गति बढ़ जाती है। एक बार जब स्कोर दूसरी सीमा तक कम हो जाता है, तो नमूने को अत्यधिक रोशनी के संपर्क में आने से बचाने के लिए माइक्रोस्कोप कम गति वाली इमेजिंग पर स्विच हो जाता है।
शोधकर्ताओं ने माइटोकॉन्ड्रियन-लक्षित फ्लोरोसेंट लेबल व्यक्त करने वाली कोशिकाओं पर ईडीए का प्रदर्शन किया। प्रत्येक ईडीए माप के दौरान, नेटवर्क ने औसतन नौ बार बैक्टीरिया विभाजन के अग्रदूतों को पहचाना। इसने औसतन 0.2 सेकंड के लिए इमेजिंग गति को धीमी (3.8 फ्रेम/सेकेंड) से तेज (10 फ्रेम/सेकंड) में बदल दिया, जिसके परिणामस्वरूप 18% फ्रेम के लिए तेज इमेजिंग हुई। उन्होंने नोट किया कि कई साइटों ने DRP1 जमा किया लेकिन विभाजन नहीं हुआ। इन साइटों ने नेटवर्क को ट्रिगर नहीं किया, जिससे रुचि की घटनाओं में भेदभाव करने की इसकी क्षमता प्रदर्शित हुई।
तुलना के लिए, टीम ने लगातार धीमी और तेज़ गति से छवियां भी एकत्र कीं। ईडीए ने निश्चित दर वाली तेज इमेजिंग की तुलना में कम नमूना फोटोब्लीचिंग का कारण बना, जिससे प्रत्येक नमूने का लंबे समय तक अवलोकन संभव हो सका और दुर्लभ माइटोकॉन्ड्रियल डिवीजन घटनाओं को कैप्चर करने की संभावना बढ़ गई। कुछ मामलों में, धीमी इमेजिंग चरणों के दौरान फोटोब्लीचिंग से नमूना बरामद हुआ, जिससे उच्च संचयी प्रकाश खुराक सक्षम हो गई।
जबकि निरंतर धीमी इमेजिंग की तुलना में ब्लीचिंग ईडीए के साथ अधिक थी, कई ईडीए सत्र नमूना स्वास्थ्य में गिरावट के बिना 10 मिनट तक पहुंच गए। शोधकर्ताओं ने यह भी पाया कि ईडीए ने विभाजन से पहले के अवरोधों को बेहतर ढंग से हल किया, साथ ही झिल्ली राज्यों की प्रगति के कारण विखंडन हुआ, जैसा कि तेज छवियों के विस्फोटों द्वारा कैप्चर किया गया था।
मैनली बताते हैं, "बुद्धिमान माइक्रोस्कोपी की क्षमता में यह मापना शामिल है कि कौन से मानक अधिग्रहण छूट जाएंगे।" "हम अधिक घटनाओं को पकड़ते हैं, छोटे अवरोधों को मापते हैं, और प्रत्येक विभाजन का अधिक विस्तार से अनुसरण कर सकते हैं।"
जीवाणु विभाजन का पता लगाना
इसके बाद, शोधकर्ताओं ने बैक्टीरिया में कोशिका विभाजन का अध्ययन करने के लिए ईडीए का उपयोग किया सी. क्रिसेंटस. जीवाणु कोशिका चक्र दसियों मिनट के समय-मान पर होता है, जो जीवित-कोशिका माइक्रोस्कोपी के लिए विशिष्ट चुनौतियाँ पैदा करता है। उन्होंने 6.7 फ्रेम/घंटा की धीमी इमेजिंग गति, 20 फ्रेम/घंटा की तेज इमेजिंग गति या ईडीए द्वारा स्विच की गई परिवर्तनीय गति पर डेटा एकत्र किया।
टीम ने पाया कि माइटोकॉन्ड्रियल संकुचन के लिए विकसित इवेंट-डिटेक्शन नेटवर्क अतिरिक्त प्रशिक्षण के बिना बैक्टीरिया विभाजन के अंतिम चरण को पहचान सकता है - संभवतः संकुचन आकार में समानता और कार्यात्मक रूप से समान आणविक मार्कर की उपस्थिति के कारण।
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फिर से, ईडीए ने निरंतर तेज़ इमेजिंग की तुलना में फोटोब्लीचिंग को कम कर दिया, और निरंतर धीमी इमेजिंग की तुलना में काफी छोटे औसत व्यास के साथ संकुचन को मापा। ईडीए ने संपूर्ण कोशिका चक्र की इमेजिंग को सक्षम किया और जीवाणु कोशिका विभाजन का विवरण प्रदान किया, जिसे एक निश्चित इमेजिंग गति का उपयोग करके कैप्चर करना मुश्किल है.
मैनली बताते हैं भौतिकी की दुनिया टीम विभिन्न प्रकार की घटनाओं का पता लगाने और विभिन्न हार्डवेयर प्रतिक्रियाओं को उत्पन्न करने के लिए इनका उपयोग करने के लिए तंत्रिका नेटवर्क को प्रशिक्षित करने की भी योजना बना रही है। "उदाहरण के लिए, हम कोशिका विभेदन में महत्वपूर्ण क्षणों में प्रतिलेखन को व्यवस्थित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक गड़बड़ी का उपयोग करने की कल्पना करते हैं," वह बताती हैं। "हम घटना का पता लगाने को डेटा संपीड़न के साधन के रूप में उपयोग करने, भंडारण या विश्लेषण के लिए डेटा के उन टुकड़ों का चयन करने के बारे में भी सोचते हैं जो किसी दिए गए अध्ययन के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक हैं।"
- शोधकर्ताओं को विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मदर्शी पर ईडीए लागू करने में सक्षम बनाने के लिए, टीम नियंत्रण ढांचा प्रदान कर रही है ओपन-सोर्स प्लग-इन माइक्रो-मैनेजर सॉफ़्टवेयर के लिए.
