Az élő sejtek fluoreszcens mikroszkópiája nélkülözhetetlen eszköz a biológiai rendszerek dinamikájának tanulmányozásához. De sok biológiai folyamat – mint például a bakteriális sejtosztódás és a mitokondriális osztódás – szórványosan megy végbe, így nehéz megragadni őket.
A minta folyamatos, nagy képkockasebességgel történő leképezése biztosítaná, hogy amikor ilyen felosztások fordulnak elő, azokat mindenképpen rögzíteni kell. A túlzott fluoreszcens képalkotás azonban fényfehérítést okoz, és idő előtt elpusztíthatja az élő mintákat. A lassabb képkockasebesség viszont azt kockáztatja, hogy elmaradnak az érdekes események. Egy olyan módszerre van szükség, amely megjósolja, mikor fog bekövetkezni egy esemény, majd utasítsa a mikroszkópot a nagy sebességű képalkotás megkezdésére.
A Lausanne-i Svájci Szövetségi Technológiai Intézet kutatói (EPFL) éppen egy ilyen rendszert hoztak létre. A csapat kifejlesztett egy eseményvezérelt adatgyűjtési (EDA) keretrendszert, amely automatizálja a mikroszkópos vezérlést a biológiai események részletes leképezéséhez, miközben csökkenti a mintára nehezedő stresszt. A neurális hálózatok segítségével az érdekes események finom előfutárainak észlelésére az EDA válaszul hozzáigazítja az adatgyűjtési paramétereket – például a képalkotás sebességét vagy a mérés időtartamát.
„Az intelligens mikroszkóp olyan, mint egy önvezető autó. Fel kell dolgoznia bizonyos típusú információkat, finom mintákat, amelyekre aztán viselkedésének megváltoztatásával reagál” – magyarázza a vezető kutató. Suliana Manley sajtónyilatkozatában. "A neurális hálózat használatával sokkal finomabb eseményeket tudunk észlelni, és felhasználni őket az adatgyűjtési sebesség megváltoztatására."
Az EDA-keretrendszer, amelyet a Természeti módszerek, egy visszacsatoló hurokból áll az élő képfolyam és a mikroszkóp vezérlői között. A kutatók Micro-Manager szoftvert használtak a mikroszkóp képeinek rögzítésére, és egy címkézett adatokra képzett neurális hálózat elemzésére. Minden egyes kép esetében a hálózati kimenet döntéshozatali paraméterként működik a lassú és gyors képalkotás közötti váltáshoz.
Esemény felismerés
Új technikájuk bemutatása érdekében Manley és munkatársai az EDA-t egy azonnali strukturált megvilágító mikroszkópba integrálták, és a mitokondriális és bakteriális osztódások szuperfelbontású time-lapse filmjeinek rögzítésére használták.
A mitokondriális osztódás előre nem látható, jellemzően néhány percenként fordul elő, és több tíz másodpercig tart. Az osztódás kezdetének előrejelzése érdekében a csapat arra tanította az ideghálózatot, hogy észlelje a szűkületeket, a mitokondriális alak változását, amely osztódáshoz vezet, valamint a DRP1 nevű fehérje jelenlétét, amely a spontán osztódásokhoz szükséges.
A neurális hálózat az „eseménypontszámok” hőtérképét adja ki, magasabb értékekkel (ha a szűkületek és a DRP1 szintjei is magasak), jelezve a képen belül azokat a helyeket, ahol nagyobb valószínűséggel fordul elő osztódás. Amint az eseménypontszám túllép egy küszöbértéket, a képalkotási sebesség növekszik, hogy az osztási eseményeket részletesen rögzítse. Amint a pontszám egy második küszöbértékre csökken, a mikroszkóp kis sebességű képalkotásra vált, hogy elkerülje a mintát túlzott fényhatásnak.
A kutatók mitokondrium-célzott fluoreszcens címkéket expresszáló sejteken végeztek EDA-t. Minden EDA-mérés során a hálózat átlagosan kilencszer ismerte fel a bakteriális osztódás prekurzorait. Ez a képalkotási sebességet lassúról (0.2 képkocka/s) gyorsra (3.8 képkocka/s) váltotta át átlagosan 10 másodpercig, ami gyors képalkotást eredményezett a képkockák 18%-ánál. Megjegyzik, hogy sok webhely felhalmozott DRP1-et, de nem vezetett megosztáshoz. Ezek a webhelyek nem indították el a hálózatot, bizonyítva, hogy képes megkülönböztetni az érdeklődésre számot tartó eseményeket.
Összehasonlításképpen a csapat állandó lassú és gyors képeket is gyűjtött. Az EDA kevesebb minta fényfehérítést okozott, mint a rögzített sebességű gyors képalkotás, lehetővé téve az egyes minták hosszabb megfigyelését, és növelve a ritka mitokondriális osztódási események rögzítésének esélyét. Egyes esetekben a minta helyreállt a fényfehérítésből a lassú képalkotási fázisok során, ami magasabb kumulatív fénydózist tesz lehetővé.
Míg a fehérítés magasabb volt az EDA-val, mint az állandó lassú képalkotásnál, sok EDA-menet elérte a 10 percet anélkül, hogy a minta állapota romlott volna. A kutatók azt is megállapították, hogy az EDA jobban feloldotta az osztódást megelőző szűkületeket, valamint a hasadáshoz vezető membránállapotok előrehaladását, amint azt a gyors felvételek rögzítik.
„Az intelligens mikroszkópiában rejlő lehetőségek közé tartozik annak mérése, hogy mi hiányozna a standard beszerzésekből” – magyarázza Manley. "Több eseményt rögzítünk, kisebb szűkítéseket mérünk, és részletesebben követjük az egyes felosztásokat."
Bakteriális osztódás kimutatása
Ezután a kutatók az EDA-t használták a baktériumok sejtosztódásának tanulmányozására C. crescentus. A bakteriális sejtciklus több tízperces időskálán megy végbe, és ez külön kihívást jelent az élő sejtmikroszkópiában. Lassú, 6.7 képkocka/óra képalkotási sebességgel, 20 képkocka/órás gyors képalkotási sebességgel vagy az EDA által kapcsolt változó sebességgel gyűjtöttek adatokat.
A csapat úgy találta, hogy a mitokondriális szűkületekre kifejlesztett eseményérzékelő hálózat további képzés nélkül is képes felismerni a bakteriális osztódás végső szakaszait – valószínűleg a szűkület alakjának hasonlóságai és egy funkcionálisan hasonló molekuláris marker jelenléte miatt.
A továbbfejlesztett mikroszkópos technika hétszer nagyobb érzékenységgel látja az élő sejteket
Az EDA ismét csökkentette a fényfehérítést az állandó gyors képalkotáshoz képest, és lényegesen kisebb átlagos átmérővel mérte a szűkületeket, mint az állandó lassú képalkotásnál. Az EDA lehetővé tette a teljes sejtciklus leképezését, és olyan részleteket közölt a bakteriális sejtosztódásról, amelyeket nehéz rögzíteni rögzített képalkotó sebességgel.
Manley elmondja Fizika Világa hogy a csapat azt is tervezi, hogy neurális hálózatokat képez ki különféle események észlelésére, és ezek felhasználásával különböző hardveres válaszokat idéz elő. „Például azt képzeljük, hogy optogenetikai zavarokat használunk fel a transzkripció modulálására a sejtdifferenciálódás kulcsfontosságú pillanataiban” – magyarázza. „Azt is gondoljuk, hogy az eseményészlelést az adattömörítés eszközeként használjuk, tárolásra vagy elemzésre kiválasztva azokat az adatokat, amelyek a legrelevánsabbak egy adott vizsgálat szempontjából.”
- Annak érdekében, hogy a kutatók az EDA-t a legkülönfélébb mikroszkópokon megvalósíthassák, a csapat a vezérlő keretrendszert biztosítja nyílt forráskódú beépülő modul a Micro-Manager szoftverhez.
