'Lobi' Tempat Massa Molekul Memberitahu Gen Apa yang Harus Dilakukan | Majalah Kuanta

Penemuan pada Proyek Genom Manusia di awal tahun 2000an bahwa kita manusia hanya memiliki sekitar 20,000 gen pengkode protein – sama banyaknya dengan cacing nematoda kecil yang hidup di tanah, dan kurang dari setengah jumlah gen penyandi tanaman padi – merupakan sebuah kejutan. . Namun, pukulan terhadap harga diri kita dilunakkan dengan gagasan bahwa genom manusia kaya akan hubungan regulasi. Gen kita berinteraksi dalam jaringan yang padat, di mana potongan DNA dan molekul yang dikodekannya (RNA dan protein) mengontrol “ekspresi” gen lain, sehingga memengaruhi apakah gen tersebut membuat RNA dan proteinnya masing-masing. Untuk memahami genom manusia, kita perlu memahami proses regulasi gen ini.

Namun, tugas tersebut terbukti jauh lebih sulit daripada menguraikan urutan genom.

Awalnya, ada dugaan bahwa regulasi gen hanyalah persoalan sederhana di mana satu produk gen bertindak sebagai saklar on/off untuk gen lain, secara digital. Pada tahun 1960an, ahli biologi Perancis François Jacob dan Jacques Monod pertama kali menjelaskan proses regulasi gen secara rinci mekanistik: In Escherichia coli bakteri, ketika protein penekan berikatan dengan segmen DNA tertentu, ia memblokir transkripsi dan translasi rangkaian gen yang berdekatan yang mengkode enzim untuk mencerna gula laktosa. Rangkaian regulasi inilah yang dijuluki Monod dan Jacob sebagai danau operon, memiliki logika yang rapi dan transparan.

Namun regulasi gen pada metazoa kompleks – hewan seperti manusia, dengan sel eukariotik yang kompleks – umumnya tidak berjalan seperti ini. Sebaliknya, hal ini melibatkan sekelompok molekul, termasuk protein, RNA, dan potongan DNA dari seluruh kromosom, yang entah bagaimana berkolaborasi untuk mengontrol ekspresi gen.

Bukan hanya proses regulasi pada eukariota yang memiliki lebih banyak pemain dibandingkan yang biasanya terlihat pada bakteri dan sel prokariotik sederhana lainnya; tampaknya ini merupakan proses yang sangat berbeda, dan lebih berbahaya.

Sebuah tim di Universitas Stanford, dipimpin oleh ahli biofisika dan bioteknologi Polly Fordyce, tampaknya kini telah mengungkap komponen mode regulasi gen yang tidak jelas ini. Pekerjaan mereka, diterbitkan September lalu di Ilmu, menunjukkan bahwa DNA di dekat suatu gen bertindak sebagai semacam sumur dangkal untuk menjebak beragam molekul pengatur, menjaga mereka tetap siap beraksi sehingga, bila diperlukan, mereka dapat ikut serta dalam pengambilan keputusan apakah akan mengaktifkan gen tersebut.

Sumur pengatur ini terbuat dari rangkaian DNA yang sangat aneh. Mereka terdiri dari rangkaian DNA pendek, dengan panjang satu hingga enam pasangan basa, berulang berkali-kali. Puluhan salinan “pengulangan tandem pendek” (STR) ini dapat dirangkai dalam urutan ini, seperti “kata” kecil yang sama yang ditulis berulang kali.

STR berlimpah dalam genom manusia: Mereka mencakup sekitar 5% dari seluruh DNA kita. Mereka pernah dianggap sebagai contoh klasik dari DNA “sampah” karena “teks” DNA berulang yang hanya terdiri dari STR tidak dapat menyimpan informasi bermakna sebanyak, katakanlah, rangkaian huruf tidak beraturan yang membentuk sebuah kalimat dalam hal ini. artikel.

Namun, STR jelas bukan hal yang sepele: STR telah dikaitkan dengan penyakit seperti penyakit Huntington, atrofi otot spinobulbar, penyakit Crohn, dan beberapa jenis kanker. Selama beberapa dekade terakhir, bukti telah terkumpul bahwa mereka dapat meningkatkan atau menghambat regulasi gen. Misterinya adalah bagaimana mereka bisa menjadi begitu kuat dengan kandungan informasi yang sangat sedikit.

Kontrol Kompleks untuk Sel Kompleks

Untuk memahami bagaimana STR cocok dengan gambaran besar regulasi gen, mari kita mundur selangkah. Gen secara rutin diapit oleh potongan DNA yang tidak mengkode RNA atau protein namun memiliki fungsi pengaturan. Gen bakteri memiliki daerah “promotor” di mana enzim polimerase dapat berikatan untuk memulai transkripsi DNA yang berdekatan menjadi RNA. Mereka juga secara rutin memiliki daerah “operator”, tempat protein penekan dapat berikatan untuk memblokir transkripsi, mematikan gen, seperti pada danau operon.

Pada manusia dan eukariota lainnya, rangkaian regulasi bisa lebih banyak, beragam, dan membingungkan. Daerah yang disebut peningkat, misalnya, mempengaruhi kemungkinan suatu gen akan ditranskripsi. Enhancer sering kali menjadi target protein yang disebut faktor transkripsi, yang dapat berikatan untuk meningkatkan atau menghambat ekspresi gen. Anehnya, beberapa peningkat berjarak puluhan ribu pasangan basa dari gen yang diaturnya, dan hanya didekatkan melalui penataan ulang fisik loop DNA dalam satu paket kromosom.

Regulasi gen eukariotik biasanya melibatkan banyak blok pengatur DNA yang beragam, bersama dengan satu atau lebih faktor transkripsi dan molekul lain, semuanya berkumpul di sekitar gen seperti sebuah komite yang berkumpul untuk memutuskan apa yang harus dilakukan. Mereka berkumpul dalam kelompok yang longgar dan padat.

Seringkali, peserta molekuler juga tampaknya tidak berinteraksi melalui pasangan “gembok dan kunci” yang sangat selektif yang umum dalam biologi molekuler. Mereka tidak terlalu pilih-pilih, berinteraksi dengan lemah dan tidak selektif, seolah-olah berkeliaran dan memulai percakapan singkat satu sama lain.

Faktanya, bagaimana faktor transkripsi mengikat DNA pada eukariota masih menjadi misteri. Sudah lama diasumsikan bahwa beberapa bagian dari faktor transkripsi harus sangat cocok dengan rangkaian “motif” yang mengikat dalam DNA, seperti potongan puzzle. Namun meskipun beberapa motif seperti itu telah diidentifikasi, keberadaannya tidak selalu berkorelasi baik dengan tempat para ilmuwan menemukan faktor transkripsi yang menempel pada DNA di dalam sel. Kadang-kadang faktor transkripsi bertahan di wilayah tanpa motif apa pun, sementara beberapa motif yang tampaknya mengikat kuat faktor transkripsi tetap kosong.

“Secara tradisional dalam genomik, tujuannya adalah mengklasifikasikan situs genom secara [biner] sebagai 'terikat' atau 'tidak terikat'” berdasarkan faktor transkripsi, kata Fordyce. “Tetapi gambarannya jauh lebih bernuansa dari itu.” Masing-masing anggota “komite” pengatur gen tersebut tampaknya tidak selalu hadir atau tidak hadir dalam pertemuan mereka, namun memiliki kemungkinan berbeda untuk hadir atau tidak.

Kecenderungan regulasi gen pada eukariota bergantung pada begitu banyak interaksi lemah yang beragam di antara kompleks molekul besar “adalah salah satu hal yang membuatnya sangat sulit untuk ditangani secara teoritis,” kata ahli biofisika tersebut. Thomas Kuhlman dari Universitas California, Riverside, yang menulis sebuah komentar pada kertas lab Fordyce untuk Ilmu. Merupakan teka-teki yang mendalam bagaimana, dari proses yang tampaknya kacau ini, muncullah keputusan yang tepat tentang menghidupkan dan mematikan gen.

Di luar logika kabur yang misterius dalam proses pengambilan keputusan tersebut, ada juga pertanyaan tentang bagaimana semua anggota komite menemukan jalan mereka ke ruangan yang tepat – dan kemudian tetap di sana. Molekul umumnya bergerak mengelilingi sel melalui difusi, diterpa oleh semua molekul lain di sekitarnya, seperti air, dan mengembara ke arah yang acak. Kita mungkin memperkirakan komite-komite yang longgar ini akan terpecah belah terlalu cepat sehingga tidak bisa menjalankan tugas mereka sebagai regulator.

Menurut Fordyce dan rekan-rekannya, di sinilah peran STR. STR sangat umum ditemukan di situs penambah DNA. Dalam makalah mereka, para peneliti berpendapat bahwa STR bertindak sebagai tempelan lengket yang mengumpulkan faktor transkripsi dan mencegahnya menyimpang.

Menyempurnakan Kelengketan

Kelompok Fordyce secara sistematis menyelidiki bagaimana perbedaan urutan STR mempengaruhi melekatnya faktor transkripsi pada motif pengikat. Mereka mengamati dua faktor – satu dari ragi, satu lagi dari manusia – yang melekat pada motif enam dasar tertentu. Para peneliti mengukur kekuatan (atau afinitas) pengikatan tersebut dan kecepatan faktor transkripsi menjadi terjebak dan terlepas (kinetika) ketika motif diapit oleh STR, bukan urutan acak. Sebagai perbandingan, mereka melihat seberapa mudah faktor-faktor tersebut berikatan dengan STR saja dan dengan rangkaian DNA yang sepenuhnya acak.

“Salah satu tantangan terbesar dalam bidang ini adalah menguraikan berbagai variabel yang memengaruhi pengikatan [faktor transkripsi] pada posisi genom tertentu,” kata David Suter, seorang ahli biologi molekuler di Institut Teknologi Federal Swiss Lausanne di Swiss. Bentuk DNA, kedekatannya dengan segmen DNA lain, dan ketegangan fisik pada molekul DNA semuanya dapat berperan dalam pengikatan faktor transkripsi. Nilai parameter ini mungkin berbeda pada setiap posisi dalam genom, dan mungkin juga antar tipe sel dan dalam satu sel seiring waktu pada posisi tertentu. “Ini adalah kumpulan variabel yang tidak diketahui dan sangat sulit untuk diukur,” kata Suter.

Itu sebabnya eksperimen yang terkontrol dengan baik seperti yang dilakukan tim Stanford sangat berguna, tambah Kuhlman. Biasanya, ketika peneliti perlu mengukur interaksi lemah seperti ini, mereka mempunyai dua pilihan: Mereka dapat membuat beberapa pengukuran yang sangat rinci, sangat tepat dan menggeneralisasikannya, atau mereka dapat melakukan banyak sekali pengukuran yang cepat dan kotor dan menggunakan perhitungan matematis yang rumit. metode statistik untuk menyimpulkan hasil. Namun Fordyce dan rekan-rekannya, kata Kuhlman, menggunakan prosedur otomatis berbasis chip mikrofluida untuk melakukan pengukuran yang tepat selama eksperimen dengan throughput tinggi “untuk mendapatkan yang terbaik dari kedua dunia.”

Tim Stanford menemukan bahwa rangkaian STR yang berbeda dapat mengubah afinitas pengikatan faktor transkripsi ke DNA sebanyak 70 kali lipat; terkadang hal ini berdampak lebih besar pada pengikatan faktor transkripsi daripada mengubah urutan motif pengikatan itu sendiri. Dan efeknya berbeda untuk dua faktor transkripsi berbeda yang mereka amati.

Jadi STR tampaknya mampu menyempurnakan kemampuan faktor transkripsi untuk berlabuh di situs DNA dan dengan demikian mengatur gen. Tapi bagaimana tepatnya?

Ruang Tunggu Dekat Gene

Para peneliti memperkirakan bahwa bagian dari faktor transkripsi yang mengikat DNA mungkin berinteraksi secara lemah dengan STR, dengan kekuatan afinitas yang tepat bergantung pada urutan STR. Karena pengikatan seperti itu lemah, maka tidak mempunyai banyak kekhususan. Namun jika faktor transkripsi secara longgar ditangkap dan dilepaskan oleh STR lagi dan lagi, efek kumulatifnya adalah menjaga faktor transkripsi tetap berada di sekitar gen sehingga lebih mungkin untuk mengikat dengan aman ke wilayah motif jika diperlukan.

Fordyce dan rekan-rekannya meramalkan bahwa STR bertindak sebagai “lobi” atau tempat di mana faktor-faktor transkripsi dapat berkumpul, betapapun sementaranya, di dekat tempat pengikatan peraturan. “Sifat STR yang berulang memperkuat efek lemah dari setiap situs pengikatan yang dibuatnya,” kata Connor Horton, penulis pertama studi tersebut, yang sekarang menjadi mahasiswa doktoral di University of California, Berkeley.

Sebaliknya, tambahnya, beberapa STR juga dapat bertindak untuk menarik faktor transkripsi dari urutan regulasi, sehingga menyerap faktor transkripsi di tempat lain seperti spons. Dengan cara ini, mereka dapat menghambat ekspresi gen.

Penelitian tersebut, kata Suter, “menunjukkan secara meyakinkan bahwa STR berdampak langsung pada pengikatan faktor transkripsi secara in vitro.” Terlebih lagi, tim Stanford menggunakan algoritma pembelajaran mesin untuk menunjukkan bahwa efek yang terlihat dalam percobaan in vitro juga tampaknya terjadi pada sel hidup (yaitu in vivo).

Tapi Robert Tjian, seorang ahli biokimia di Berkeley dan peneliti di Howard Hughes Medical Institute, berpendapat bahwa mungkin terlalu dini untuk memastikan apa pengaruh kombinasi faktor transkripsi STR terhadap ekspresi gen dalam sel sebenarnya.

Tjian, Xavier Darzacq dan rekan-rekan mereka di laboratorium yang mereka jalankan bersama di Berkeley setuju bahwa STR tampaknya menawarkan cara untuk memusatkan faktor transkripsi di dekat lokasi pengatur gen. Namun tanpa mengetahui seberapa dekat faktor-faktor yang diperlukan untuk mengaktifkan transkripsi, sulit untuk memahami signifikansi fungsional dari hasil tersebut. Tjian mengatakan dia ingin melihat apakah memasukkan STR ke dalam sel hidup dapat mempengaruhi ekspresi gen target. Saat ini, katanya, “tidak yakin bahwa STR akan menjadi aspek utama dari mekanisme [peraturan] in vivo.”

Tata Bahasa Kombinatorial

Salah satu teka-teki yang masih tersisa adalah bagaimana mekanisme tersebut secara andal menyediakan jenis regulasi gen tepat yang dibutuhkan sel, karena kekuatan dan selektivitas pengikatan faktor transkripsi dalam sumur STR lemah. Fordyce berpendapat bahwa kekhususan pengaruh tersebut dapat berasal dari banyak sumber – tidak hanya dari perbedaan rangkaian STR tetapi juga dari interaksi kooperatif antara faktor transkripsi dan protein lain yang terlibat dalam regulasi.

Mengingat semua itu, kata Horton, tidak jelas apakah akan mudah untuk memprediksi efek kombinasi faktor transkripsi STR terhadap ekspresi gen. Logika prosesnya memang tidak jelas. Dan “tata bahasa” pengaruhnya mungkin bersifat kombinatorial, Horton menambahkan: Hasilnya bergantung pada kombinasi faktor transkripsi dan molekul lain yang berbeda.

Tim Stanford berpendapat bahwa mungkin 90% faktor transkripsi sensitif terhadap STR, namun terdapat lebih banyak jenis faktor transkripsi dalam genom manusia dibandingkan jenis STR. “Mutasi rangkaian STR mungkin mempengaruhi pengikatan 20 faktor transkripsi berbeda dalam tipe sel tersebut, yang menyebabkan penurunan transkripsi gen di dekatnya secara keseluruhan tanpa melibatkan faktor transkripsi spesifik apa pun,” kata Horton.

Jadi, tim Stanford sependapat dengan Tjian bahwa regulasi gen dalam sel hidup tidak akan didorong oleh satu mekanisme sederhana. Sebaliknya, faktor transkripsi, tempat pengikatan DNA, dan molekul pengatur lainnya dapat berkumpul menjadi kumpulan padat yang memberikan pengaruhnya secara kolektif.

“Sekarang ada banyak contoh yang mendukung gagasan bahwa elemen DNA dapat memenuhi faktor transkripsi hingga membentuk kondensat dengan kofaktor,” kata Richard Young, seorang ahli biologi sel di Whitehead Institute dari Massachusetts Institute of Technology. Enhancer mengikat banyak faktor transkripsi untuk menghasilkan crowding tersebut. STR mungkin merupakan bahan yang membantu mengumpulkan faktor-faktor transkripsi untuk berkumpul di dekat suatu gen, tetapi STR bukanlah keseluruhan cerita.

Mengapa mengatur gen dengan cara yang rumit ini, daripada mengandalkan interaksi yang kuat dan spesifik antara protein pengatur dan situs DNA yang mendominasi pada prokariota? Ada kemungkinan bahwa ketidakjelasan seperti itulah yang membuat metazoa kompleks berukuran besar menjadi mungkin terjadi.

Untuk menjadi spesies yang dapat bertahan hidup, organisme harus mampu berevolusi dan beradaptasi terhadap perubahan keadaan. Jika sel-sel kita bergantung pada suatu jaringan interaksi regulasi gen yang sangat besar dan ketat, maka akan sulit untuk membuat perubahan apa pun terhadapnya tanpa mengganggu keseluruhan alat tersebut, sama seperti jam tangan Swiss yang akan rusak jika kita menghilangkan (atau bahkan sedikit mengganti) sel-sel yang ada. dari segudang roda giginya. Namun, jika interaksi regulasi molekulernya longgar dan tidak spesifik, terdapat kelemahan yang berguna dalam sistem – seperti halnya sebuah komite pada umumnya dapat mengambil keputusan yang baik bahkan jika salah satu anggotanya sedang sakit.

Fordyce mencatat bahwa pada prokariota seperti bakteri, faktor transkripsi mungkin relatif mudah menemukan situs pengikatannya karena genom yang akan dicari lebih kecil. Namun hal ini menjadi lebih sulit karena genomnya semakin besar. Dalam genom eukariota yang besar, “Anda tidak dapat lagi mentoleransi risiko bahwa Anda akan terjebak pada situs pengikatan yang 'salah' untuk sementara,” kata Fordyce, karena hal itu akan membahayakan kemampuan untuk merespons dengan cepat terhadap perubahan kondisi lingkungan.

Selain itu, STR sendiri sangat mudah dikembangkan. Pemanjangan atau pemendekan urutannya, atau perubahan ukuran dan kedalaman “sumur faktor transkripsi”, dapat terjadi dengan mudah melalui kesalahan dalam replikasi atau perbaikan DNA, atau melalui rekombinasi seksual pada kromosom. Bagi Fordyce, hal ini menunjukkan bahwa STR “oleh karena itu dapat berfungsi sebagai bahan mentah untuk mengembangkan elemen peraturan baru dan menyempurnakan modul peraturan yang ada untuk program transkripsional yang sensitif,” seperti yang mengatur pengembangan hewan dan tumbuhan.

Kekuatan Interaksi yang Lemah

Pertimbangan seperti ini membuat para ahli biologi molekuler memberikan lebih banyak perhatian pada interaksi yang lemah dan relatif tidak selektif dalam genom. Banyak di antaranya melibatkan protein yang, alih-alih memiliki struktur yang tetap dan tepat, malah menjadi longgar dan terkulai – “secara intrinsik tidak teratur,” seperti yang dikatakan oleh para ahli biokimia. Jika protein hanya bekerja melalui domain struktural yang kaku, Young menjelaskan, hal ini tidak hanya akan membatasi seberapa baik sistem regulasi dapat berkembang tetapi juga jenis regulasi dinamis yang terlihat dalam kehidupan. “Anda tidak akan menemukan organisme hidup – atau bahkan virus – yang berfungsi hanya dengan elemen struktural yang stabil seperti yang ada pada jam tangan Swiss,” kata Young.

Mungkin evolusi baru saja menemukan STR sebagai komponen solusi yang kompleks namun pada akhirnya lebih efektif terhadap regulasi gen pada eukariota. STR sendiri dapat muncul dalam beberapa cara – misalnya, melalui kesalahan dalam replikasi DNA atau aktivitas segmen DNA yang disebut elemen transposable yang membuat salinan dirinya di seluruh genom.

“Kebetulan interaksi lemah yang muncul antara protein dan rangkaian berulang adalah sesuatu yang dapat… memberikan keuntungan selektif pada sel di mana interaksi tersebut terjadi,” kata Kuhlman. Dugaannya adalah bahwa ketidakjelasan ini mungkin dipaksakan pada eukariota, namun “mereka kemudian dapat mengeksploitasinya untuk keuntungan mereka sendiri.” Bakteri dan prokariota lainnya dapat mengandalkan logika regulasi “digital” yang terdefinisi dengan baik karena sel mereka cenderung hanya berada dalam beberapa keadaan sederhana dan berbeda, seperti bergerak dan bereplikasi.

Namun keadaan sel yang berbeda untuk metazoa “jauh lebih kompleks dan terkadang mendekati sebuah kontinum,” kata Suter, sehingga mereka lebih baik dilayani oleh regulasi “analog” yang lebih kabur.

“Sistem pengaturan gen pada bakteri dan eukariota tampaknya telah berbeda secara substansial,” Tjian menyetujui. Sedangkan Monod konon pernah mengatakan bahwa “apa yang benar E. coli hal ini juga berlaku pada gajah,” nampaknya tidak selalu demikian.