Mikroskop fluoresensi sel hidup menyediakan alat yang sangat diperlukan untuk mempelajari dinamika sistem biologis. Namun banyak proses biologis – seperti pembelahan sel bakteri dan pembelahan mitokondria, misalnya – terjadi secara sporadis, sehingga sulit untuk ditangkap.
Mencitrakan sampel secara terus-menerus pada kecepatan bingkai tinggi akan memastikan bahwa ketika pembagian tersebut benar-benar terjadi, pembagian tersebut pasti akan direkam. Namun pencitraan fluoresensi yang berlebihan menyebabkan photobleaching dan dapat menghancurkan sampel hidup sebelum waktunya. Sementara itu, frame rate yang lebih lambat berisiko kehilangan peristiwa penting. Yang dibutuhkan adalah cara untuk memprediksi kapan suatu peristiwa akan terjadi dan kemudian menginstruksikan mikroskop untuk memulai pencitraan berkecepatan tinggi.
Para peneliti di Institut Teknologi Federal Swiss Lausanne (EPFL) telah menciptakan sistem seperti itu. Tim mengembangkan kerangka akuisisi berbasis peristiwa (EDA) yang mengotomatiskan kontrol mikroskop untuk menggambarkan peristiwa biologis secara detail sekaligus membatasi tekanan pada sampel. Dengan menggunakan jaringan saraf untuk mendeteksi prekursor halus dari peristiwa menarik, EDA mengadaptasi parameter akuisisi – seperti kecepatan pencitraan atau durasi pengukuran – sebagai respons.
“Mikroskop cerdas itu seperti mobil yang dapat mengemudi sendiri. Ia perlu memproses jenis informasi tertentu, pola halus yang kemudian ditanggapi dengan mengubah perilakunya,” jelas peneliti utama Suliana Manley dalam pernyataan pers. “Dengan menggunakan jaringan saraf, kami dapat mendeteksi peristiwa yang lebih halus dan menggunakannya untuk mendorong perubahan dalam kecepatan akuisisi.”
Kerangka kerja EDA, dijelaskan dalam Metode Alam, terdiri dari putaran umpan balik antara aliran gambar langsung dan kontrol mikroskop. Para peneliti menggunakan perangkat lunak Micro-Manager untuk mengambil gambar dari mikroskop dan jaringan saraf yang dilatih pada data berlabel untuk menganalisisnya. Untuk setiap gambar, keluaran jaringan bertindak sebagai parameter pengambilan keputusan untuk beralih antara pencitraan lambat dan cepat.
Pengenalan acara
Untuk mendemonstrasikan teknik baru mereka, Manley dan rekannya mengintegrasikan EDA ke dalam mikroskop iluminasi terstruktur instan dan menggunakannya untuk menangkap film time-lapse pembelahan mitokondria dan bakteri dengan resolusi super.
Pembelahan mitokondria tidak dapat diprediksi, biasanya terjadi setiap beberapa menit sekali dan berlangsung selama puluhan detik. Untuk memprediksi permulaan pembelahan, tim melatih jaringan saraf untuk mendeteksi penyempitan, perubahan bentuk mitokondria yang mengarah pada pembelahan, dikombinasikan dengan keberadaan protein yang disebut DRP1 yang diperlukan untuk pembelahan spontan.
Jaringan saraf mengeluarkan peta panas “skor peristiwa”, dengan nilai yang lebih tinggi (saat penyempitan dan tingkat DRP1 tinggi) yang menunjukkan lokasi dalam gambar di mana pembagian lebih mungkin terjadi. Setelah skor peristiwa melebihi nilai ambang batas, kecepatan pencitraan meningkat untuk menangkap peristiwa pembagian secara detail. Setelah skor berkurang hingga ambang batas kedua, mikroskop beralih ke pencitraan kecepatan rendah untuk menghindari sampel terkena cahaya berlebihan.
Para peneliti melakukan EDA pada sel yang mengekspresikan label fluoresen yang ditargetkan pada mitokondria. Selama setiap pengukuran EDA, jaringan mengenali prekursor pembelahan bakteri rata-rata sembilan kali. Ini mengubah kecepatan pencitraan dari lambat (0.2 frame/dtk) menjadi cepat (3.8 frame/dtk) selama rata-rata 10 detik, menghasilkan pencitraan cepat untuk 18% frame. Mereka mencatat bahwa banyak situs mengumpulkan DRP1 tetapi tidak menyebabkan perpecahan. Situs-situs ini tidak memicu jaringan tersebut, sehingga menunjukkan kemampuannya untuk mendiskriminasi peristiwa-peristiwa yang menarik.
Sebagai perbandingan, tim juga mengumpulkan gambar dengan kecepatan lambat dan cepat yang konstan. EDA menyebabkan lebih sedikit photobleaching sampel dibandingkan pencitraan cepat dengan kecepatan tetap, sehingga memungkinkan pengamatan yang lebih lama pada setiap sampel dan meningkatkan kemungkinan menangkap peristiwa pembelahan mitokondria yang langka. Dalam beberapa kasus, sampel pulih dari photobleaching selama fase pencitraan lambat, sehingga memungkinkan dosis cahaya kumulatif yang lebih tinggi.
Meskipun pemutihan lebih tinggi dengan EDA dibandingkan dengan pencitraan lambat yang konstan, banyak sesi EDA yang mencapai 10 menit tanpa penurunan kesehatan sampel. Para peneliti juga menemukan bahwa EDA lebih baik menyelesaikan penyempitan sebelum pembelahan, serta perkembangan keadaan membran yang mengarah ke fisi, seperti yang ditangkap oleh semburan gambar cepat.
“Potensi mikroskop cerdas termasuk mengukur apa yang akan dilewatkan oleh akuisisi standar,” jelas Manley. “Kami mengabadikan lebih banyak peristiwa, mengukur batasan yang lebih kecil, dan dapat mengikuti setiap divisi dengan lebih detail.”
Mendeteksi pembelahan bakteri
Selanjutnya, para peneliti menggunakan EDA untuk mempelajari pembelahan sel pada bakteri C. bulan sabit. Siklus sel bakteri terjadi dalam skala waktu puluhan menit, menciptakan tantangan tersendiri bagi mikroskop sel hidup. Mereka mengumpulkan data pada kecepatan pencitraan lambat 6.7 frame/jam, kecepatan pencitraan cepat 20 frame/jam, atau kecepatan variabel yang dialihkan oleh EDA.
Tim menemukan bahwa jaringan pendeteksi peristiwa yang dikembangkan untuk penyempitan mitokondria dapat mengenali tahap akhir pembelahan bakteri tanpa pelatihan tambahan – kemungkinan karena kesamaan dalam bentuk penyempitan dan adanya penanda molekuler yang serupa secara fungsional.
Teknik mikroskop yang ditingkatkan melihat sel-sel hidup dengan sensitivitas tujuh kali lebih besar
Sekali lagi, EDA mengurangi photobleaching dibandingkan dengan pencitraan cepat yang konstan, dan mengukur penyempitan dengan diameter rata-rata yang jauh lebih kecil dibandingkan dengan pencitraan lambat yang konstan. EDA memungkinkan pencitraan seluruh siklus sel dan memberikan rincian pembelahan sel bakteri yang sulit ditangkap menggunakan kecepatan pencitraan tetap.
Manley menceritakan Dunia Fisika bahwa tim juga berencana untuk melatih jaringan saraf untuk mendeteksi berbagai jenis peristiwa dan menggunakannya untuk membangkitkan respons perangkat keras yang berbeda. “Misalnya, kami membayangkan memanfaatkan gangguan optogenetik untuk memodulasi transkripsi pada momen-momen penting dalam diferensiasi sel,” jelasnya. “Kami juga mempertimbangkan untuk menggunakan deteksi peristiwa sebagai sarana kompresi data, memilih penyimpanan atau menganalisis bagian data yang paling relevan dengan penelitian tertentu.”
- Untuk memungkinkan para peneliti menerapkan EDA pada berbagai macam mikroskop, tim menyediakan kerangka kontrol sebagai plugin sumber terbuka untuk perangkat lunak Micro-Manager.
