La microscopia di espansione consente la nanoimaging con un microscopio convenzionale

La microscopia di espansione è una tecnica di imaging biologico che consente l'imaging su scala nanometrica utilizzando un microscopio a fluorescenza a diffrazione limitata convenzionale. Funziona incorporando i campioni in un idrogel rigonfiabile in acqua e quindi espandendo il gel. Questo espande fisicamente le biomolecole l'una dall'altra, consentendo il loro interrogatorio a una risoluzione precedentemente ottenibile solo utilizzando costose tecniche di imaging ad alta risoluzione.

Gli attuali protocolli di microscopia di espansione, tuttavia, non sono ottimizzati per un'adozione diffusa. I campioni devono essere trattati con agenti di ancoraggio personalizzati per collegare specifiche biomolecole ed etichette all'idrogel. Inoltre, la maggior parte degli approcci ha raggiunto solo un'espansione del tessuto di circa quattro volte, limitando la risoluzione effettiva a circa 70 nm su un microscopio ottico convenzionale con una lente dell'obiettivo a diffrazione limitata di 280 nm.

Per superare queste carenze, una squadra diretta a Carnegie Mellon University ha sviluppato una nuova strategia di microscopia di espansione chiamata Magnify. Il protocollo, descritto in Nature Biotechnology, utilizza un nuovo idrogel meccanicamente robusto che conserva uno spettro di biomolecole senza richiedere una fase di ancoraggio separata.

Magnify può espandere i campioni fino a 11 volte, consentendo l'imaging di cellule e tessuti con una risoluzione effettiva di circa 25 nm utilizzando un microscopio convenzionale. Se combinato con l'imaging di fluttuazione ottica a super risoluzione (SOFI, un metodo di post-elaborazione computazionale), ha raggiunto una risoluzione effettiva di circa 15 nm.

I precedenti protocolli di microscopia di espansione richiedevano anche l'eliminazione di molte biomolecole che tengono insieme i tessuti. "Per rendere le cellule davvero espandibili, è necessario utilizzare gli enzimi per digerire le proteine, quindi alla fine hai avuto un gel vuoto con etichette che indicano la posizione della proteina di interesse", spiega l'autore senior Yongxin Zhao In una dichiarazione stampa.

“Uno dei principali punti di forza di Magnify è la strategia universale per mantenere le biomolecole del tessuto, comprese proteine, acidi nucleici e carboidrati, all'interno del campione espanso. Le molecole vengono mantenute intatte e più tipi di biomolecole possono essere etichettati in un singolo campione», aggiunge Zhao.

Ampie applicazioni

Zhao e colleghi hanno applicato Magnify a un'ampia gamma di tipi di tessuto. L'imaging di una sezione cerebrale di topo espansa di 11 volte colorata per il contenuto proteico totale, ad esempio, ha consentito la visualizzazione dell'architettura nanoscopica delle singole sinapsi nel cervello. Magnify ha dimostrato un potere di risoluzione effettivo di circa 18 nm utilizzando una lente dell'obiettivo × 60 (limite di diffrazione di circa 200 nm).

I ricercatori hanno confermato la bassa distorsione ottenuta dal protocollo Magnify su diversi tipi di tessuto, utilizzando la pre-espansione SOFI e la post-espansione della microscopia confocale. Non hanno trovato cambiamenti morfologici sostanziali tra le immagini pre e post-espansione dei nuclei cellulari e dei marcatori proteici a livello macroscopico o di sub-diffrazione.

Il team ha anche testato Magnify su una gamma di campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina, che sono tra i più importanti preparati per biopsia, ma sono difficili da espandere con i protocolli attuali. Ciò includeva sezioni di tessuto di rene, mammella, cervello e colon e tumori corrispondenti. Magnify potrebbe espandere i campioni di fattori di circa 8.00-10.77 in acqua, a seconda del tipo di tessuto.

Uno degli obiettivi chiave era rendere Magnify adatto a un'ampia gamma di campioni di tessuto, facilitandone l'adozione da parte dei ricercatori che cercavano di adottare il nuovo protocollo. "Funziona con diversi tipi di tessuto, metodi di fissazione e persino tessuto che è stato preservato e conservato", afferma il co-primo autore Brandan Gallagher. “È molto flessibile, in quanto non è necessario riprogettare completamente gli esperimenti pensando a Magnify; funzionerà con quello che hai già.

Aumentare la risoluzione

Per dimostrare l'ulteriore aumento della risoluzione effettiva reso possibile dall'associazione di Magnify con SOFI, i ricercatori hanno utilizzato la combinazione per visualizzare organoidi polmonari umani, in particolare le ciglia che funzionano per eliminare il muco nelle vie aeree. Con un diametro di 200 nm e una lunghezza di pochi micrometri, queste strutture sono solitamente troppo piccole per essere viste senza l'utilizzo di tecnologie come la microscopia elettronica (EM).

Magnify-SOFI potrebbe risolvere completamente la struttura cava delle ciglia e dei corpi basali, compreso l'anello esterno precedentemente mostrato da EM per comprendere nove fasci di microtubuli. I ricercatori hanno stimato la risoluzione effettiva di circa 14-17 nm (utilizzando una lente dell'obiettivo a diffrazione limitata di 280 nm). Sono stati anche in grado di visualizzare difetti nelle ciglia nelle cellule polmonari con mutazioni genetiche.

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"Con le ultime tecniche di Magnify, possiamo espandere quei tessuti polmonari e iniziare a vedere alcune ultrastrutture delle ciglia mobili anche con un normale microscopio, e questo accelererà sia le indagini di base che quelle cliniche", commenta il coautore Xi Ren.

Sulla base del successo dello sviluppo di Magnify, il team lo sta ora utilizzando per studiare campioni di tessuto ancora più complessi. "Ciò include l'esplorazione di tessuti infetti e campioni più grandi come interi organi", dice Zhao Mondo della fisica. “Inoltre, stiamo lavorando per ottimizzare Magnify per studiare campioni umani patologici e studiare i cambiamenti su scala nanometrica nel cervello durante i processi di apprendimento e le malattie. Con queste scoperte, ci si possono aspettare ulteriori scoperte da questo campo di studio molto promettente».

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• Fonte: https://physicsworld.com/a/expansion-microscopy-enables-nanoimaging-with-a-conventional-microscope/