Fluorescentiemicroscopie van levende cellen biedt een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van de dynamiek van biologische systemen. Maar veel biologische processen – zoals bacteriële celdeling en mitochondriale deling bijvoorbeeld – komen sporadisch voor, waardoor het lastig is ze vast te leggen.
Het voortdurend in beeld brengen van een monster met een hoge framesnelheid zou ervoor zorgen dat wanneer dergelijke verdelingen optreden, deze zeker zullen worden opgenomen. Maar overmatige fluorescentiebeeldvorming veroorzaakt fotobleking en kan levende monsters voortijdig vernietigen. Bij een lagere framesnelheid bestaat het risico dat interessante gebeurtenissen worden gemist. Wat nodig is, is een manier om te voorspellen wanneer een gebeurtenis op het punt staat te gebeuren en vervolgens de microscoop te instrueren om met hogesnelheidsbeeldvorming te beginnen.
Onderzoekers van het Zwitserse Federale Instituut voor Technologie Lausanne (EPFL) hebben precies zo'n systeem gemaakt. Het team ontwikkelde een event-driven acquisition (EDA)-framework dat de microscoopcontrole automatiseert om biologische gebeurtenissen in detail in beeld te brengen en tegelijkertijd de stress op het monster te beperken. Met behulp van neurale netwerken om subtiele voorlopers van interessante gebeurtenissen te detecteren, past EDA de acquisitieparameters – zoals beeldsnelheid of meetduur – als reactie aan.
“Een intelligente microscoop is een soort zelfrijdende auto. Het moet bepaalde soorten informatie verwerken, subtiele patronen waarop het vervolgens reageert door zijn gedrag te veranderen”, legt hoofdonderzoeker uit Suliana Manley in een persverklaring. “Door een neuraal netwerk te gebruiken, kunnen we veel subtielere gebeurtenissen detecteren en deze gebruiken om veranderingen in de acquisitiesnelheid te bewerkstelligen.”
Het EDA-framework, beschreven in Nature Methods, bestaat uit een feedbacklus tussen een live beeldstream en de microscoopbedieningen. De onderzoekers gebruikten Micro-Manager-software om beelden van de microscoop vast te leggen en een neuraal netwerk dat getraind was op gelabelde gegevens om deze te analyseren. Voor elk beeld fungeert de netwerkuitvoer als een beslissingsparameter om te schakelen tussen langzame en snelle beeldvorming.
Herkenning van evenementen
Om hun nieuwe techniek te demonstreren, integreerden Manley en collega's EDA in een instant gestructureerde verlichtingsmicroscoop en gebruikten deze om superopgeloste time-lapse-films van mitochondriale en bacteriële divisies vast te leggen.
De mitochondriale deling is onvoorspelbaar, treedt doorgaans eens in de paar minuten op en duurt tientallen seconden. Om het begin van deling te voorspellen, trainde het team het neurale netwerk om vernauwingen te detecteren, een verandering in de vorm van de mitochondriën die tot deling leidt, gecombineerd met de aanwezigheid van een eiwit genaamd DRP1 dat nodig is voor spontane delingen.
Het neurale netwerk voert een heatmap uit van ‘gebeurtenisscores’, waarbij hogere waarden (wanneer zowel de vernauwingen als de DRP1-niveaus hoog zijn) locaties binnen het beeld aangeven waar de kans groter is dat er deling plaatsvindt. Zodra de gebeurtenisscore een drempelwaarde overschrijdt, neemt de beeldsnelheid toe om de divisiegebeurtenissen in detail vast te leggen. Zodra de score tot een tweede drempel daalt, schakelt de microscoop over op beeldvorming op lage snelheid om te voorkomen dat het monster aan overmatig licht wordt blootgesteld.
De onderzoekers voerden EDA uit op cellen die op mitochondriën gerichte fluorescerende labels tot expressie brengen. Tijdens elke EDA-meting herkende het netwerk gemiddeld negen keer de voorlopers van bacteriële deling. Hierdoor werd de beeldsnelheid gedurende gemiddeld 0.2 seconden omgeschakeld van langzaam (3.8 frames/s) naar snel (10 frames/s), wat resulteerde in een snelle beeldvorming voor 18% van de frames. Ze merken op dat veel sites DRP1 hebben verzameld, maar niet tot verdeeldheid hebben geleid. Deze sites hebben het netwerk niet geactiveerd, wat aantoont dat het netwerk in staat is om belangrijke gebeurtenissen te onderscheiden.
Ter vergelijking verzamelde het team ook beelden met constante lage en hoge snelheden. EDA veroorzaakte minder fotobleking van monsters dan snelle beeldvorming met vaste snelheid, waardoor langere observaties van elk monster mogelijk waren en de kans groter werd dat zeldzame mitochondriale delingsgebeurtenissen werden vastgelegd. In sommige gevallen herstelde het monster zich van fotobleken tijdens de langzame beeldvormingsfasen, waardoor een hogere cumulatieve lichtdosis mogelijk was.
Hoewel het bleken hoger was bij EDA dan bij constante langzame beeldvorming, duurden veel EDA-sessies 10 minuten zonder verslechtering van de gezondheid van het monster. De onderzoekers ontdekten ook dat EDA de vernauwingen voorafgaand aan de deling beter oploste, evenals de progressie van membraantoestanden die tot splijting leidden, zoals vastgelegd door de uitbarstingen van snelle beelden.
"Het potentieel van intelligente microscopie omvat het meten van wat standaard acquisities zouden missen", legt Manley uit. "We leggen meer gebeurtenissen vast, meten kleinere vernauwingen en kunnen elke divisie in meer detail volgen."
Het detecteren van bacteriële deling
Vervolgens gebruikten de onderzoekers EDA om de celdeling in de bacterie te bestuderen C. crescentus. De bacteriële celcyclus vindt plaats op een tijdschaal van tientallen minuten, wat duidelijke uitdagingen creëert voor microscopie van levende cellen. Ze verzamelden gegevens met een lage beeldsnelheid van 6.7 frames/uur, een hoge beeldsnelheid van 20 frames/uur of een variabele snelheid geschakeld door EDA.
Het team ontdekte dat het gebeurtenisdetectienetwerk dat is ontwikkeld voor mitochondriale vernauwingen de laatste stadia van bacteriële deling zou kunnen herkennen zonder aanvullende training – waarschijnlijk als gevolg van overeenkomsten in de vorm van de vernauwing en de aanwezigheid van een functioneel vergelijkbare moleculaire marker.
Verbeterde microscopietechniek ziet levende cellen met zeven keer meer gevoeligheid
Opnieuw verminderde EDA de fotobleken in vergelijking met constante snelle beeldvorming, en mat vernauwingen met aanzienlijk kleinere gemiddelde diameters dan met constante langzame beeldvorming. EDA maakte beeldvorming van de gehele celcyclus mogelijk en leverde details van bacteriële celdeling op die moeilijk vast te leggen zijn met een vaste beeldsnelheid.
Manley vertelt Natuurkunde wereld dat het team ook van plan is neurale netwerken te trainen om verschillende soorten gebeurtenissen te detecteren en deze te gebruiken om verschillende hardwarereacties op te roepen. "We stellen ons bijvoorbeeld voor om optogenetische verstoringen te benutten om de transcriptie op sleutelmomenten in celdifferentiatie te moduleren", legt ze uit. “We denken er ook aan om gebeurtenisdetectie te gebruiken als een middel voor datacompressie, waarbij we de stukjes data selecteren die het meest relevant zijn voor een bepaald onderzoek voor opslag of analyse.”
- Om onderzoekers in staat te stellen EDA op een breed scala aan microscopen te implementeren, levert het team het controleframework als een open source plug-in voor de Micro-Manager-software.
