Denne gangen for et år siden, Steve Horvath lette etter pangolin-DNA. Den eldgamle skjellete maurslukeren ville være den første for samlingen hans, som da var rundt 200 pattedyr sterk. "Jeg hadde ikke noe av den ordren, og det er grunnen til at jeg desperat ønsket dem," husket han.
Siden sommeren 2017 har Horvath, som inntil nylig var en antialdringsforsker ved University of California, Los Angeles, har brukt så mye som 10 timer om dagen på å skrive e-poster til dyreparker, museer, akvarier og laboratorier. Han har deltatt på foredrag om flaggermus og tasmanske djevler for å møte vokterne deres. Han har nådd ut til verdens ytterste hjørner og tigger om DNAet til flygende rever, vervet-aper, minigriser og grønlandshval.
Med det enorme mengderiet av prøver har han bygget beregningsklokker som kan beregne alderen til så forskjellige skapninger som spissmus, koalaer, sebraer, griser og "hver hval du kan navngi," sa han, bare ved å se på DNA-et deres. Men dette var bare skritt mot fullføringen av Horvaths ambisiøse månebilde av et prosjekt: en universell klokke som kunne måle den biologiske alderen til ethvert pattedyr.
Å måle alder kan se ut til å ikke være vanskeligere enn å bruke nærmeste klokke eller kalender. Men kronologisk alder er en ufullkommen beregning siden noen individer og vev viser effekten av alder raskere enn andre. I flere tiår har forskere søkt etter en objektiv og allsidig måte å måle biologisk aldring, endringene i sunn funksjon over tid. "Du vil ha en biomarkør som nøyaktig måler alder i mange forskjellige vev og celletyper," sa Horvath, som forlot UCLA i år for å bli hovedetterforsker ved Altos Labs, en bioteknologisk oppstart som jobber mot foryngelse av celler.
Horvath og kollegene hans fullførte en versjon av pan-pattedyrklokken tidligere i år. Nå håper han og andre forskere å identifisere de molekylære prosessene som er felles for forskjellige skapninger som gjør en slik klokke mulig. Å forstå hvorfor klokker som denne fungerer, tror Horvath, kan bidra til å lede oss til det han kaller «den sanne årsaken til aldring».
Klokkene hans er basert på analyser av de kjemiske merkene kalt metylgrupper som henger på DNA som sjarm på et armbånd og hjelper til med å kontrollere genaktivitet. De er produkter av epigenetikk (bokstavelig talt "over genetikk"), feltet som studerer arvelig informasjon som ikke er skrevet i den genetiske koden. For et dusin år siden begynte Horvath og kollegene å bruke sin kunnskap til å bygge klokkene, først for å vurdere alderen på DNA fra spytt, og senere for å bestemme alderen til blod, lever og andre individuelle vev.
Mange biologer var skeptiske til å begynne med fordi klokkene var forankret i statistikk snarere enn en forståelse av biomolekylære mekanismer. Likevel stod nøyaktigheten til klokkene opp til tester og sendte krusninger gjennom det biomedisinske samfunnet. Forskere begynte å bruke Horvath-klokker i sin forskning for å måle aldring av celler fordi klokkene var bedre dommere av kroppens tilstand og risikoen for sykdom enn kronologisk alder. "Epigenetiske klokker er nærmere den faktiske aldringsprosessen enn noen andre biomarkører," sa Vadim Gladyshev, en biokjemiker ved Brigham and Women's Hospital og Harvard Medical School som studerer kreft og aldring. Nå leder klokkene noen forskere til å revurdere ideene sine om hva aldring er, så vel som dets sammenheng med sykdommer.
"Jeg har nå samarbeidspartnere som jobber mye med brystkreft og [begynner] å tenke på: 'Hvis du har avansert biologisk aldring, er det også informativt for brystkreft?'" sa Sara Hägg, en molekylær epidemiolog ved Karolinska Institutet i Stockholm, Sverige. Hvis klokkene på en nyttig måte kan belyse hvordan man stopper aldringsprosessen fra å utløse aldersrelaterte lidelser, la hun til, "vi kan forhindre ikke bare én sykdom, men mange."
Ser et signal
Gang på gang i de siste tiårene trodde biologiske forskere at en klokke for aldring var innen rekkevidde. For eksempel lærte de på begynnelsen av 1960-tallet at celler som vokser i kultur ikke er udødelige, men i stedet dør etter bare 40-60 replikasjonsrunder, noe som antydet at celler har en slags aldringsklokke. I 1982 trodde forskere at de kunne ha funnet klokkens mekanisme da de isolerte telomerer, DNA-proteinkomplekser i endene av kromosomene som forkortes hver gang en celle deler seg; når telomerer blir kritisk korte, dør cellene.
Men telomerer fungerte ikke som en aldrende klokke. Korrelasjonen mellom telomerlengde med alder og dødelighet er svak hos mennesker og ikke-eksisterende hos noen andre arter. "Telomere [lengde] sporer faktisk ikke alder. Det sporer bare celleproliferasjon," sa Ken Raj, en hovedetterforsker ved Altos Labs.
Som et alternativ til telomerlengde begynte Horvath i 2009 å jobbe med en klokke basert på RNA-transkripsjonene av en celles aktive gener, malene for proteinene som definerer en celle og lar den fungere. I de neste to årene prøvde han å få den tilnærmingen til å fungere, til ingen nytte: Transkripsjonsdataene var bare for mye støy.
Men i 2010 svarte Horvath på en forespørsel om hjelp fra en kollega ved UCLA. For å studere mulige sammenhenger mellom seksuell legning og epigenetikk, samlet forskeren spytt fra identiske tvillinger som var forskjellige i seksuell legning, med den hypotese at DNA i spyttcellene deres kan avsløre noen konsistente forskjeller i metyleringsmønstre. Horvaths tvillingbror er homofil; Horvath er heteroseksuell. De forsynte seg med spyttet.
Studiens analyse så på steder i DNA hvor cytosinbaser er lokalisert og sjekket hvilke av dem som var metylert. (Cytosiner er de eneste basene som metylgrupper fester seg til.) En nylig introdusert lab-on-a chip-teknologi gjorde det enkelt å teste titusenvis av cytosinsteder i hver celles DNA. Da kollegaen trengte en statistiker for å analysere dataene, meldte Horvath seg frivillig.
Han fant ikke det de lette etter. "Det var ikke noe signal overhodet for homofili," sa Horvath. "Men fordi dataene var på datamaskinen min, sa jeg, la meg se på aldringseffekter," siden alderen til tvillingene i studien strakte seg over flere tiår.
Inntil da hadde Horvath styrt unna epigenetiske data i sin egen forskning. Forholdet mellom metyleringsmønstre og genuttrykk er rotete og indirekte, og det hadde virket usannsynlig å vise mye nyttig sammenheng med aldring. Men nå som han hadde denne uventede epigenetiske data til rådighet, virket det ingen skade å se.
Horvath begynte å matche metyleringsmønstrene med tvillingenes alder. I en spyttprøve - eller hvilken som helst prøve fra et hvilket som helst vev - vil ikke alle cellene vise det samme metyleringsmønsteret. Men andelen celler som er metylert ved et gitt cytosin i DNA kan måles. I en prøve, for eksempel, kan 40 % av cellene være metylert i en bestemt posisjon; i en annen kan denne andelen være 45 % eller 60 %.
Til hans overraskelse fant Horvath en sterk sammenheng mellom alder og andelen celler med metylering, selv når han så på bare ett sted i DNA. Å se på flere steder økte nøyaktigheten.
"Dette endret alt for meg," sa han. "Når jeg så på signalet for aldring, blåste det meg bort."
Horvath bygde en modell som spådde en persons alder fra metyleringsstatusen til rundt 300 cytosiner over millioner av celler i en spyttprøve. "Du spytter i en kopp, og vi kan måle alderen din," sa han.
Snart bygde han epigenetiske klokkemodeller for å evaluere den biologiske alderen til blod, lever, hjerne og forskjellige andre vev. Først målte han proporsjonene av celler i hver prøve som viste metylering på spesifikke steder. Fra disse dataene laget han profiler av vevene som beskrev proporsjonene av celler metylert på hvert sted.
For å bygge en klokke matet han en datamaskin med tusenvis av epigenetiske profiler sammen med alderen til hvert vev som ble profilert. Gjennom maskinlæring koblet datamaskinen alder til metyleringsmønstre. Det begrenset også antallet nettsteder som trengs for å forutsi alder. Datamaskinen vektet deretter betydningen av hvert nettsteds metylering i sine beregninger for å lage den beste prediktive formelen for alder, som Horvath testet på et eget sett med prøver av kjente aldre.
I løpet av to år hadde han kombinert deres separate vevaldringsklokker til én formel for en "pan-vev"-klokke, publisert i 2013. Pan-vev-klokken var "game changer," sa Daniel Belsky, en epidemiolog ved Columbia Mailman School of Public Health. Formelen brukes på alle menneskelige celler som inneholder DNA. Og hvem som helst kunne bruke det - Horvath la programvaren på internett. Ved å laste opp sine egne metyleringsdata kunne biologer finne ut hvor mye tid som hadde tatt på cellene i prøvene deres.
Kvantifisere nedgang
Horvaths pan-vev-klokke var mirakuløst nøyaktig til å forutsi kronologisk alder. Det så også ut til å reflektere viktige underliggende forskjeller mellom kronologisk og biologisk alder. Forskere oppdaget at når den epigenetiske klokken estimerte at noens alder var høyere enn deres kronologiske alder, sto personen overfor en høyere risiko for sykdom og død. Da klokken anslo at noen var yngre, gikk risikoen ned. Selv om den epigenetiske klokken ble avledet fra kronologiske aldersdata, spådde algoritmen dødelighet bedre enn alder gjorde.
Så på slutten av 2014 satte Horvath ut for å spore biologisk alder eksplisitt. Han og hans kolleger, inkludert Morgan Levine (en patologiforsker ved Yale University som nylig begynte i Altos Labs) og Luigi Ferrucci fra National Institute on Aging, trent en algoritme på et sammensatt mål som inkluderte kronologisk alder samt resultatene av ni blodkjemi-tester som forutsier sykdom og dødelighet. Dataene kom fra blodet til mer enn 9,900 voksne i National Health and Nutrition Examination Survey. Den resulterende klokken, DNAm PhenoAge, publisert i 2018, spådde blant annet total dødelighet og risiko for hjerte- og karsykdommer, lungesykdommer, kreft og diabetes. Et år senere ga Horvath og et team ledet av Ake T. Lu fra UCLA ut en enda mer presis prediktor for tid til død, Grim alder, som så på en persons kjønn, kronologiske alder, røykehistorie og blodproteindødelighetsmarkører.
Et nytt verktøy fra Belsky og hans kolleger, introdusert i 2020 og oppdatert tidligere i år, fungerer som et aldrende speedometer. I å skape deres Aldringstempo biomarkør, kvantifiserte de endringshastigheten i 19 markører for organfunksjon ved fire aldre, kompilerte dem til en enkelt indeks og modellerte den med metylering. "Vi kvantifiserer faktisk den pågående prosessen med aldersrelatert nedgang og systemintegritet," sa Belsky. De som eldes raskere ved dette tiltaket dør yngre, sa han, og la til at det forutsier dødelighet omtrent like godt som GrimAge og kan forutsi slag og demens enda bedre.
Aldergamle spørsmål
I 2017 henvendte representanter for Paul G. Allen Family Foundation seg til Horvath etter en av samtalene hans. De likte arbeidet hans og foreslo at han drømmer stort, fordi stiftelsen støtter høyrisikobestræbelser. Finn et prosjekt som ingen andre ville finansiere, sa de.
Det tok ikke Horvath lang tid å foreslå en aldrende klokke som ville gjelde for alle virveldyr. Forslaget gikk igjennom - det var merkelig nok - men etter hvert som Horvath innså omfanget av hva det ville innebære, forvandlet planen seg til en relativt behersket klokke for alle pattedyr.
I januar 2021 hadde Horvath metyleringsdata fra 128 pattedyrarter, og han satte klokken sin på preprint-serveren biorxiv.org. «Den samme matematiske formelen, de samme cytosinene for en mus eller en rotte eller en hund eller en gris. Vi kan måle aldring i alle disse artene, sa Horvath. Likevel søkte han kloden etter mer.
På sensommeren i fjor var Horvath i kontakt med Darren Pietersen, en pangolinekspert ved Tikki Hywood Foundation i Harare, Zimbabwe, og tilbyr ham forsyninger for å samle inn data fra pangoliner og flere andre arter. Ingen visste engang sikkert hvor lenge pangoliner lever. Noen offisielle kontoer sa 15 til 20 år, men Pietersen trodde i det minste noen typer lever lenger. "Det ene dyret som vi eldet nylig var omtrent 34 år gammelt (men med en ganske bred feilmargin)," skrev han.
Fra de medfølgende vevsdataene bygde Horvath en pangolin-klokke, enda en levetidstidtaker å legge til samlingen hans. «Du vil ha en griseklokke, jeg har en griseklokke. Jeg har en klokke for kenguruer og for elefanter," sa Horvath. Hver artsspesifikk klokke var en velsignelse for forskere på feltet. Elefantforskere, for eksempel, ønsket elefantklokken slik at de kunne fastslå aldersstrukturen til ville populasjoner for å hjelpe bevaringsarbeidet.
Men en klokke som slår sammen dem alle kan bidra til å svare på et mer grunnleggende spørsmål: Hva er aldring? Et syn er at kroppen din eldes som skoene dine, gradvis falmer og faller fra hverandre. Men de vellykkede spådommene fra pan-pattedyr-klokken antyder at noe også får celler til å svikte etter en viss tidsplan, kanskje på grunn av utviklingsgener som ikke slår seg av når arbeidet er ferdig. "Dette antyder et element av determinisme i aldring," sa Raj, en av klokkens mer enn 100 byggere.
Data fra metyleringsklokker tyder på at aldring starter veldig tidlig, lenge før kroppen brytes ned. I en 2021 papir, beskriver Gladyshev og hans kolleger en metyleringsklokke som daterer stadier av pattedyrutvikling. De fant at under tidlig embryogenese hos mus, en slags foryngelse slår tilbake embryoets alder til null. Biologisk aldring fortsetter så raskt, selv om menneskebarn uten tvil blir sterkere, ikke svakere, i løpet av denne tiden, og dødeligheten hos mennesker avtar til rundt 9 år. "Det er for meg veldig dyptgående fordi det nagler dette spørsmålet om aldring til en prosess som er uløselig fra utviklingsprosessen," sa Raj.
To nyere studier av den nakne føflekrotten, en gnager med en usannsynlig lang levetid på 37 år, viser at dyret eldes epigenetisk, selv om sjansene for å dø ikke øker med kronologisk alder. "Jeg tror dødeligheten ikke er det beste målet på aldring," sa Gladyshev, som ledet en av studiene. "Aldring er en uunngåelig konsekvens av å være i live."
Aldring reflekterer fortsatt effekten av erfaring, atferd og miljøet, selvfølgelig. Røyking og soleksponering, for eksempel, kan akselerere det, målt ved metylering og andre markører, og trening eller lavkaloridiett kan stoppe det. I arbeid publisert i mars i fjor, en epigenetisk klokke skreddersydd for murmeldyr viste at dvalemodus bremser aldring, og et papir publisert forrige uke viste at det samme gjelder for flaggermus. En klokke laget for rhesus makaker antyder at orkanen Maria i 2017 fremskyndet aldring i en koloni av apekatter på en øy utenfor kysten av Puerto Rico.
Original Sin
Ingen vet helt hvorfor klokkene fungerer. Noen, men ikke alle, av genene og de molekylære banene som er involvert er identifisert, og forskere lærer fortsatt hvordan metyleringsmønstre påvirker atferden og helsen til celler, vev og organer. "Det kommer tilbake til det jeg kaller "konstruksjonens opprinnelige synd," sa Horvath. "Den er basert på en [statistisk] regresjonsmodell som på et eller annet nivå er agnostisk for biologi."
For å sone for denne synden har Raj og Horvath begynt å søke biologiske korrelater for epigenetisk aldring. Forstyrrelser av de biokjemiske banene kroppen bruker for å føle behovet for næringsstoffer sakte aldring, oppdaget de nylig, i samsvar med effekten av kaloribegrensede dietter på aldring. Avsporing av funksjonene til mitokondrier øker hastigheten. Klokken sporer også modningen av stamceller. Hvis disse prosessene henger sammen på et dypere nivå, kan epigenetiske klokker avsløre samlende mekanismer for aldring, skrev forfatterne i en 2022 papir inn Natur aldring.
Hva disse samlende mekanismene kan være eller hvorfor metyleringsstatus sporer aldring så godt, er imidlertid ennå ikke helt bestemt. "Vi vet egentlig ikke om epigenetiske klokker er årsakssammenheng med aldring," sa Hägg.
Selv om de er det, måler epigenetiske klokker nesten helt sikkert bare en del av det som skjer under aldring, sa Matt Kaeberlein, en forsker ved University of Washington School of Medicine i Seattle som studerer biologien til aldring. "Om de faktisk måler mer enn én enkelt dimensjon av biologisk alder er ikke klart," sa han. "Dette er en del av problemet her - sammenblandingen av epigenetisk alder med biologisk alder. De er ikke like etter mitt syn.»
Raj spekulerer i at metyleringsendringene reflekterer tap av cellulær identitet med alderen. Alle celler i kroppen har samme DNA, så det som gjør en levercelle til en levercelle og en hjertecelle til en hjertecelle er mønsteret for genuttrykk, som epigenetikken styrer. Ettersom endringer i metylering akkumuleres med alderen, kan noen av disse kontrollene gå tapt, erstattet av nye utviklingsprogrammer som bør slås av, foreslår Raj.
Selv om metyleringsklokker kan være de mest nøyaktige monitorene av biologisk alder for nå, noen studier antyder det er rom for forbedring. En mer presis prediktor kan kombinere kvantifiserbare cellulære egenskaper - for eksempel protein-, metabolitt- eller genuttrykksnivåer - med fysiologiske signaler og en skrøpelighetsindeks. "Vi kan måle så mange ting i et menneske nå," sa Hägg. "Jo flere av disse tingene du kvantifiserer, jo mer nøyaktig vil du fange opp aldringen din."
Metyleringsklokker har også begrenset klinisk bruk, advarte Hägg. Folk kan kjøpe en avlesning av sin biologiske alder fra ulike kommersielle kilder, men ikke bare er resultatene ofte inkonsekvente, de mangler klinisk relevans fordi klokkene var ment for analyse på gruppenivå i forskning. "De er ikke bygget for å være prediktive på individuelt nivå," sa hun.
Og selv om noen endrer livsstilen sin på en måte som senker deres biologiske alder målt av disse klokkene, vil de ha et lengre liv eller lavere risiko for sykdom? "Vi vet ikke det ennå," sa Kaeberlein.
Horvath forbereder nå et papir om sin pan-pattedyrklokke for innsending til en journal. Selv om han tilsynelatende har nådd målet sitt, maser fortsatt hull i samlingen på ham. I mai korresponderte han med seniorkuratorer ved et museum i Australia om å skaffe vev fra pungdyrføflekker, en liten, stort sett blind skapning som tilbringer mesteparten av tiden sin under jorden. "Vi har allerede generert data fra 348 pattedyrarter, men vi vil gjerne legge til flere," sa han.
Da Horvath foreslo dette prosjektet, bestemte han seg for å analysere 30 arter, men 30 ble snart 50, så 100, så mer enn tre ganger så mye. "Jeg trenger å ta fart," sa han, "fordi jeg har denne impulsen til å samle mer."
