Fluorescensmikroskopi av levende celler gir et uunnværlig verktøy for å studere dynamikken til biologiske systemer. Men mange biologiske prosesser – som bakteriecelledeling og mitokondriedeling, for eksempel – skjer sporadisk, noe som gjør dem utfordrende å fange.
Kontinuerlig avbildning av en prøve ved en høy bildefrekvens vil sikre at når slike oppdelinger oppstår, vil de definitivt bli registrert. Men overdreven fluorescensavbildning forårsaker fotobleking og kan ødelegge levende prøver for tidlig. En langsommere bildefrekvens risikerer i mellomtiden å gå glipp av interessante hendelser. Det som trengs er en måte å forutsi når en hendelse er i ferd med å skje og deretter instruere mikroskopet til å starte høyhastighetsavbildning.
Forskere ved Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL) har laget nettopp et slikt system. Teamet utviklet et hendelsesdrevet anskaffelsesrammeverk (EDA) som automatiserer mikroskopkontroll for å avbilde biologiske hendelser i detalj samtidig som det begrenser stress på prøven. Ved å bruke nevrale nettverk for å oppdage subtile forløpere til hendelser av interesse, tilpasser EDA innhentingsparametrene – for eksempel bildehastighet eller målingsvarighet – som respons.
"Et intelligent mikroskop er på en måte som en selvkjørende bil. Den trenger å behandle visse typer informasjon, subtile mønstre som den deretter reagerer på ved å endre atferden sin, forklarer rektor. Suliana Manley i en pressemelding. "Ved å bruke et nevralt nettverk kan vi oppdage mye mer subtile hendelser og bruke dem til å drive endringer i innhentingshastighet."
EDA-rammeverket, beskrevet i Naturmetoder, består av en tilbakemeldingssløyfe mellom en levende bildestrøm og mikroskopkontrollene. Forskerne brukte Micro-Manager-programvare for å ta bilder fra mikroskopet og et nevralt nettverk trent på merkede data for å analysere dem. For hvert bilde fungerer nettverksutgangen som en beslutningsparameter for å veksle mellom langsom og rask bildebehandling.
Begivenhetsgjenkjenning
For å demonstrere sin nye teknikk, integrerte Manley og kollegene EDA i et øyeblikkelig strukturert belysningsmikroskop og brukte det til å fange superoppløste time-lapse-filmer av mitokondrie- og bakteriedeling.
Mitokondriell deling er uforutsigbar, forekommer vanligvis en gang med noen få minutter og varer i titalls sekunder. For å forutsi begynnelsen av deling, trente teamet det nevrale nettverket til å oppdage innsnevringer, en endring i mitokondriell form som fører til deling, kombinert med tilstedeværelsen av et protein kalt DRP1 som er nødvendig for spontane delinger.
Det nevrale nettverket sender ut et varmekart med "hendelsesscore", med høyere verdier (når både innsnevringer og DRP1-nivåer er høye) som indikerer steder i bildet hvor det er mer sannsynlig at deling vil forekomme. Når hendelsespoengsummen overskrider en terskelverdi, øker bildehastigheten for å fange opp delingshendelsene i detalj. Når poengsummen reduseres til en andre terskel, bytter mikroskopet til lavhastighetsavbildning for å unngå å utsette prøven for mye lys.
Forskerne utførte EDA på celler som uttrykker mitokondrier-målrettede fluorescerende etiketter. Under hver EDA-måling gjenkjente nettverket forløpere til bakteriedeling ni ganger i gjennomsnitt. Dette endret bildehastigheten fra sakte (0.2 bilder/s) til rask (3.8 bilder/s) i gjennomsnittlig 10 s, noe som resulterte i rask bildebehandling for 18 % av bildene. De bemerker at mange nettsteder akkumulerte DRP1, men førte ikke til deling. Disse nettstedene utløste ikke nettverket, noe som viser dets evne til å diskriminere hendelser av interesse.
Til sammenligning samlet teamet også bilder med konstant sakte og høye hastigheter. EDA forårsaket mindre prøvefotobleking enn fasthastighets rask bildebehandling, noe som muliggjorde lengre observasjoner av hver prøve og økte sjansene for å fange sjeldne mitokondriedelingshendelser. I noen tilfeller kom prøven seg fra fotobleking under de langsomme bildefasene, noe som muliggjorde en høyere kumulativ lysdose.
Mens bleking var høyere med EDA enn for konstant langsom bildebehandling, nådde mange EDA-økter 10 minutter uten forringelse av prøvehelsen. Forskerne fant også at EDA bedre løste innsnevringene før divisjonen, så vel som progresjonen av membrantilstander som førte til fisjon, som fanget av utbruddene av raske bilder.
"Potensialet til intelligent mikroskopi inkluderer å måle hva standardoppkjøp ville gå glipp av," forklarer Manley. "Vi fanger opp flere hendelser, måler mindre innsnevringer og kan følge hver divisjon mer detaljert."
Påvisning av bakteriedeling
Deretter brukte forskerne EDA til å studere celledeling i bakteriene C. crescentus. Den bakterielle cellesyklusen skjer på en tidsskala på titalls minutter, og skaper distinkte utfordringer for levende-celle-mikroskopi. De samlet inn data med en langsom bildehastighet på 6.7 bilder/t, en rask bildehastighet på 20 bilder/time eller en variabel hastighet byttet av EDA.
Teamet fant at hendelsesdeteksjonsnettverket utviklet for mitokondrielle innsnevringer kunne gjenkjenne de siste stadiene av bakteriedeling uten ekstra trening - sannsynligvis på grunn av likheter i innsnevringsform og tilstedeværelsen av en funksjonelt lignende molekylær markør.
Forbedret mikroskopiteknikk ser levende celler med syv ganger mer følsomhet
Igjen reduserte EDA fotobleking sammenlignet med konstant rask avbildning, og målte innsnevringer med betydelig mindre gjennomsnittlige diametre enn med konstant langsom avbildning. EDA muliggjorde avbildning av hele cellesyklusen og ga detaljer om bakteriecelledeling som er vanskelig å fange med en fast bildehastighet.
Manley forteller Fysikkens verden at teamet også planlegger å trene nevrale nettverk til å oppdage forskjellige typer hendelser og bruke disse til å fremkalle forskjellige maskinvareresponser. "For eksempel ser vi for oss å utnytte optogenetiske forstyrrelser for å modulere transkripsjon på nøkkeløyeblikk i celledifferensiering," forklarer hun. "Vi tenker også på å bruke hendelsesdeteksjon som et middel for datakomprimering, ved å velge for lagring eller analyse de dataene som er mest relevante for en gitt studie."
- For å gjøre det mulig for forskere å implementere EDA på et bredt utvalg av mikroskoper, gir teamet kontrollrammeverket som et åpen kildekode-plugin for Micro-Manager-programvaren.
