RALEIGH – Nazwij to zagadką CRISPR.
Bakterie wykorzystują systemy CRISPR-Cas jako adaptacyjne układy odpornościowe, aby przeciwstawić się atakom wrogów, takim jak wirusy. Naukowcy zaadaptowali te systemy do usuwania lub wycinania i zastępowania określonych sekwencji kodu genetycznego w różnych organizmach.
[CRISPR Cas Według Narodowego Instytutu Zdrowia, to adaptacyjny układ odpornościowy występujący u większości bakterii i archeonów, zapobiegający ich zakażeniu przez fagi, wirusy i inne obce elementy genetyczne.]
Rodolphe Barrangou (zdjęcie NCSU)
Jednak w nowym badaniu naukowcy z North Carolina State University wykazali, że wirusy zaprojektowane przy użyciu systemu CRISPR-Cas mogą udaremnić obronę bakterii i wprowadzić selektywne zmiany w docelowej bakterii – nawet jeśli inne bakterie znajdują się w pobliżu.
„Wirusy są bardzo dobre w dostarczaniu ładunków. W tym przypadku używamy wirusa bakteryjnego, bakteriofaga, aby dostarczyć CRISPR bakteriom, co jest ironią losu, ponieważ bakterie zwykle używają CRISPR do zabijania wirusów” – powiedział Rudolfa Barrangou, Todd R. Klaenhammer, wybitny profesor nauk o żywności, bioprzetwarzaniu i żywieniu w stanie NC oraz autor korespondujący z artykułem opisującym badania opublikowanym dzisiaj w Proceedings of the National Academy of Sciences. „Wirus w tym przypadku celuje E. coli dostarczając mu DNA. To jak używać wirusa jako strzykawki.”
Badacze z NC State wykorzystali dwa różne zmodyfikowane bakteriofagi w celu dostarczenia ładunków CRISPR-Cas do ukierunkowanej edycji E. coli, najpierw w probówce, a następnie w syntetycznym środowisku glebowym stworzonym na wzór gleby – złożonego środowiska, w którym może znajdować się wiele rodzajów bakterii.
Obydwa zmodyfikowane bakteriofagi, zwane T7 i lambda, z powodzeniem znalazły, a następnie dostarczyły ładunek do E. coli gospodarz na stole laboratoryjnym. Ładunki te eksprymowały bakteryjne geny fluorescencyjne i manipulowały opornością bakterii na antybiotyk.
Następnie badacze wykorzystali lambdę do dostarczenia do komputera tak zwanego edytora zasad cytozyny E. coli gospodarz. Zamiast czasami ostrego cięcia sekwencji DNA w CRISPR, ten podstawowy edytor zmienił tylko jedną literę E coli'DNA, pokazujące czułość i precyzję systemu. Zmiany te inaktywowały pewne geny bakteryjne, nie wprowadzając innych zmian E. coli.
„Użyliśmy tutaj podstawowego edytora jako swego rodzaju programowalnego włącznika/wyłącznika dla genów E. coli. Korzystając z takiego systemu, możemy dokonać bardzo precyzyjnych jednoliterowych zmian w genomie bez pękania dwuniciowego DNA powszechnie kojarzonego z celowaniem CRISPR-Cas” – powiedział Matthew Nethery, były doktorant stanu NC. studentka i główna autorka badania.
Na koniec badacze zademonstrowali edycję na miejscu za pomocą sztucznego ekosystemu (EcoFAB) zawierającego syntetyczne podłoże glebowe składające się z piasku i kwarcu oraz cieczy, aby naśladować środowisko glebowe. Naukowcy uwzględnili także trzy różne typy bakterii, aby sprawdzić, czy fag może konkretnie zlokalizować E. coli w systemie.
„W laboratorium naukowcy mogą nadmiernie upraszczać sprawy” – powiedział Barrangou. „Lepiej modelować środowiska, więc zamiast zupy w probówce, chcieliśmy zbadać środowiska rzeczywiste”.
Naukowcy wprowadzili lambdę do sfabrykowanego ekosystemu. Wykazał się dobrą skutecznością w znajdowaniu E. coli i dokonanie ukierunkowanych zmian genetycznych.
„Ta technologia umożliwi naszemu zespołowi i innym osobom odkrycie genetycznych podstaw kluczowych interakcji bakterii z roślinami i innymi drobnoustrojami w ściśle kontrolowanych środowiskach laboratoryjnych, takich jak EcoFAB” – powiedział Trent Northen, naukowiec z Laboratorium Krajowego Lawrence Berkeley przy Departamencie Energii (Berkeley Lab), który współpracuje z Barrangou.
„Postrzegamy to jako mechanizm wspomagający mikrobiom. Możemy dokonać zmiany w konkretnej bakterii, a reszta mikrobiomu pozostanie nienaruszona” – powiedział Barrangou. „To dowód na słuszność koncepcji, którą można zastosować w dowolnej złożonej społeczności drobnoustrojów, co może przełożyć się na lepsze zdrowie roślin i przewód pokarmowy – środowiska ważne dla żywności i zdrowia.
„Ostatecznie to badanie stanowi kolejny rozdział w dostarczaniu CRISPR – wykorzystanie wirusów do dostarczania maszyn CRISPR w złożonym środowisku”.
Naukowcy planują kontynuować te prace, testując technikę fagowego CRISPR z innymi bakteriami żyjącymi w glebie. Co ważne, ilustruje to, w jaki sposób można manipulować zbiorowiskami drobnoustrojów glebowych w celu kontrolowania składu i funkcji bakterii związanych z roślinami w sztucznych ekosystemach, aby zrozumieć, w jaki sposób wspomagać wzrost roślin i promować zdrowie roślin, co ma szerokie znaczenie dla zrównoważonego rolnictwa.
Finansowanie zapewniła organizacja m-CAFE Microbial Community Analysis & Functional Evaluation in Soils, obszar naukowy kierowany przez Laboratorium Krajowe Lawrence Berkeley i wspierany przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych na mocy umowy nr. DE-AC02-05CH11231, dzięki wspólnym wysiłkom obejmującym Uniwersytet Kalifornijski w Berkeley i Instytut Innowacyjnej Genomiki. Współautorami artykułu są Nethery, były pracownik naukowy ze stopniem doktora NC State Claudio Hidalgo-Cantabrana i absolwentka stanu NC Avery Roberts.
(C) NCSU
