Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek stanowi niezastąpione narzędzie do badania dynamiki układów biologicznych. Jednak wiele procesów biologicznych – takich jak na przykład podział komórek bakteryjnych i podział mitochondriów – zachodzi sporadycznie, co utrudnia ich uchwycenie.
Ciągłe obrazowanie próbki z dużą liczbą klatek na sekundę zapewni, że w przypadku wystąpienia takich podziałów, zostaną one na pewno zarejestrowane. Jednak nadmierne obrazowanie fluorescencyjne powoduje fotowybielanie i może przedwcześnie zniszczyć żywe próbki. Tymczasem mniejsza liczba klatek na sekundę grozi pominięciem interesujących wydarzeń. Potrzebny jest sposób przewidzenia, kiedy zdarzenie ma nastąpić, a następnie poinstruowanie mikroskopu, aby rozpoczął obrazowanie z dużą szybkością.
Naukowcy ze Szwajcarskiego Federalnego Instytutu Technologii w Lozannie (EPFL) stworzyli właśnie taki system. Zespół opracował platformę akwizycji sterowanej zdarzeniami (EDA), która automatyzuje kontrolę mikroskopu w celu szczegółowego obrazowania zdarzeń biologicznych, ograniczając jednocześnie obciążenie próbki. Wykorzystując sieci neuronowe do wykrywania subtelnych prekursorów interesujących zdarzeń, EDA w odpowiedzi dostosowuje parametry akwizycji – takie jak prędkość obrazowania lub czas trwania pomiaru.
„Inteligentny mikroskop przypomina trochę autonomiczny samochód. Musi przetwarzać określone rodzaje informacji, subtelne wzorce, na które następnie reaguje, zmieniając swoje zachowanie” – wyjaśnia główny badacz Suliany Manley w oświadczeniu prasowym. „Korzystając z sieci neuronowej, możemy wykryć znacznie bardziej subtelne zdarzenia i wykorzystać je do zmiany szybkości akwizycji”.
Ramy EDA opisane w Metody przyrodnicze, składa się z pętli sprzężenia zwrotnego pomiędzy strumieniem obrazu na żywo a elementami sterującymi mikroskopu. Naukowcy wykorzystali oprogramowanie Micro-Manager do przechwytywania obrazów z mikroskopu oraz sieć neuronową trenowaną na oznakowanych danych w celu ich analizy. Dla każdego obrazu dane wyjściowe sieciowe pełnią rolę parametru decyzyjnego umożliwiającego przełączanie pomiędzy wolnym i szybkim obrazowaniem.
Rozpoznawanie zdarzeń
Aby zademonstrować swoją nową technikę, Manley i współpracownicy zintegrowali EDA z natychmiastowym strukturalnym mikroskopem oświetleniowym i wykorzystali go do przechwytywania superrozdzielczych filmów poklatkowych przedstawiających podziały mitochondriów i bakterii.
Podział mitochondriów jest nieprzewidywalny, zwykle zachodzi raz na kilka minut i trwa dziesiątki sekund. Aby przewidzieć początek podziału, zespół wytrenował sieć neuronową pod kątem wykrywania zwężeń, czyli zmian w kształcie mitochondriów prowadzących do podziału, w połączeniu z obecnością białka zwanego DRP1 wymaganego do spontanicznych podziałów.
Sieć neuronowa generuje mapę cieplną „wyników zdarzeń” z wyższymi wartościami (kiedy zarówno zwężenia, jak i poziomy DRP1 są wysokie) wskazującymi miejsca na obrazie, w których prawdopodobieństwo wystąpienia podziału jest większe. Gdy wynik zdarzenia przekroczy wartość progową, prędkość obrazowania wzrasta, aby szczegółowo uchwycić zdarzenia podziału. Gdy wynik spadnie do drugiego progu, mikroskop przełącza się na obrazowanie z niską prędkością, aby uniknąć narażenia próbki na nadmierne światło.
Naukowcy przeprowadzili EDA na komórkach wykazujących ekspresję znaczników fluorescencyjnych ukierunkowanych na mitochondria. Podczas każdego pomiaru EDA sieć rozpoznawała prekursory podziału bakterii średnio dziewięć razy. Spowodowało to przełączenie szybkości obrazowania z wolnej (0.2 klatki/s) na dużą (3.8 klatki/s) przez średnio 10 s, co skutkowało szybkim obrazowaniem dla 18% klatek. Zauważają, że wiele witryn zgromadziło DRP1, ale nie doprowadziło to do podziału. Witryny te nie uruchomiły sieci, co pokazało jej zdolność do rozróżniania interesujących wydarzeń.
Dla porównania zespół zebrał także obrazy przy stałej, małej i dużej prędkości. EDA powodowała mniejsze fotowybielanie próbek niż szybkie obrazowanie ze stałą szybkością, umożliwiając dłuższe obserwacje każdej próbki i zwiększając szanse na uchwycenie rzadkich zdarzeń podziału mitochondriów. W niektórych przypadkach próbka odzyskała siły po fotowybielaniu podczas powolnych faz obrazowania, co umożliwiło zastosowanie wyższej skumulowanej dawki światła.
Chociaż wybielanie było większe w przypadku EDA niż w przypadku ciągłego powolnego obrazowania, wiele sesji EDA osiągnęło 10 minut bez pogorszenia stanu próbki. Naukowcy odkryli również, że EDA lepiej rozwiązała zwężenia poprzedzające podział, a także postęp stanów błony prowadzących do rozszczepienia, co uchwyciły serie szybkich obrazów.
„Potencjał inteligentnej mikroskopii obejmuje pomiar tego, czego nie udałoby się uzyskać w przypadku standardowych akwizycji” – wyjaśnia Manley. „Przechwytujemy więcej zdarzeń, mierzymy mniejsze zwężenia i możemy bardziej szczegółowo śledzić każdy podział”.
Wykrywanie podziału bakterii
Następnie naukowcy wykorzystali EDA do badania podziału komórek u bakterii C. półksiężyc. Cykl komórkowy bakterii trwa kilkadziesiąt minut, co stanowi szczególne wyzwanie dla mikroskopii żywych komórek. Zebrali dane przy małej szybkości obrazowania wynoszącej 6.7 klatek na godzinę, dużej szybkości obrazowania wynoszącej 20 klatek na godzinę lub przy zmiennej prędkości przełączanej przez EDA.
Zespół odkrył, że sieć wykrywania zdarzeń opracowana dla zwężeń mitochondriów może rozpoznawać końcowe etapy podziału bakterii bez dodatkowego szkolenia – prawdopodobnie ze względu na podobieństwa kształtu zwężeń i obecność funkcjonalnie podobnego markera molekularnego.
Ulepszona technika mikroskopowa pozwala zobaczyć żywe komórki z siedmiokrotnie większą czułością
Ponownie EDA zmniejszyła fotowybielanie w porównaniu ze stałym szybkim obrazowaniem i zmierzyła zwężenia przy znacznie mniejszych średnich średnicach niż w przypadku ciągłego powolnego obrazowania. EDA umożliwiła obrazowanie całego cyklu komórkowego i dostarczyła szczegółów podziału komórek bakteryjnych, które są trudne do uchwycenia przy stałej szybkości obrazowania.
Manley opowiada Świat Fizyki że zespół planuje także wytrenować sieci neuronowe w zakresie wykrywania różnego rodzaju zdarzeń i wykorzystywania ich do wywoływania różnych reakcji sprzętu. „Przewidujemy na przykład wykorzystanie zaburzeń optogenetycznych do modulowania transkrypcji w kluczowych momentach różnicowania komórek” – wyjaśnia. „Myślimy również o wykorzystaniu wykrywania zdarzeń jako środka kompresji danych, wybierając do przechowywania lub analizy fragmenty danych, które są najbardziej istotne dla danego badania”.
- Aby umożliwić naukowcom wdrożenie EDA w szerokiej gamie mikroskopów, zespół udostępnia ramy kontrolne w postaci narzędzia wtyczka typu open source dla oprogramowania Micro-Manager.
