Desta vez, há um ano, Steve Horvath estava procurando DNA de pangolim. O antigo tamanduá escamoso seria o primeiro em sua coleção, que contava então com cerca de 200 mamíferos. “Eu não tinha nada dessa ordem, e é por isso que os queria desesperadamente”, lembrou ele.
Desde o verão de 2017, Horvath, que até recentemente era pesquisador antienvelhecimento da Universidade da Califórnia, em Los Angeles, passou até 10 horas por dia escrevendo e-mails para zoológicos, museus, aquários e laboratórios. Ele participou de palestras sobre morcegos e demônios da Tasmânia para conhecer seus tratadores. Ele alcançou os cantos mais distantes do mundo, implorando pelo DNA de raposas voadoras, macacos-vervet, miniporcos e baleias-da-groenlândia.
Com esse vasto conjunto de amostras, ele construiu relógios computacionais que podem calcular a idade de criaturas tão diversas como musaranhos, coalas, zebras, porcos e “todas as baleias que você puder nomear”, disse ele, apenas observando seu DNA. Mas esses foram apenas passos em direção à conclusão do ambicioso projeto lunar de Horvath: um relógio universal que pudesse medir a idade biológica de qualquer mamífero.
Medir a idade pode não parecer mais difícil do que usar o relógio ou calendário mais próximo. Mas a idade cronológica é uma métrica imperfeita, uma vez que alguns indivíduos e tecidos mostram os efeitos da idade mais rapidamente do que outros. Durante décadas, os cientistas procuraram uma forma objetiva e versátil de medir o envelhecimento biológico, as mudanças na função saudável ao longo do tempo. “Queremos ter um biomarcador que meça com precisão as idades em muitos tecidos e tipos de células diferentes”, disse Horvath, que deixou a UCLA este ano para se tornar investigador principal no Altos Labs, uma startup de biotecnologia que trabalha no rejuvenescimento das células.
Horvath e seus colegas completaram uma versão do relógio pan-mamífero no início deste ano. Agora ele e outros pesquisadores esperam identificar os processos moleculares comuns a diversas criaturas que tornam possível esse relógio. Entender por que relógios como este funcionam, acredita Horvath, poderia ajudar a nos levar ao que ele chama de “a verdadeira causa raiz do envelhecimento”.
Seus relógios são baseados em análises de etiquetas químicas chamadas grupos metil, que ficam penduradas no DNA como amuletos em uma pulseira e ajudam a controlar a atividade genética. São produtos da epigenética (literalmente, “acima da genética”), o campo que estuda informações hereditárias não escritas no código genético. Há uma dúzia de anos, Horvath e os seus colegas começaram a aplicar o seu conhecimento na construção de relógios, primeiro para avaliar a idade do ADN da saliva e, mais tarde, para determinar a idade do sangue, do fígado e de outros tecidos individuais.
Muitos biólogos inicialmente ficaram céticos porque os relógios estavam enraizados em estatísticas, e não na compreensão dos mecanismos biomoleculares. No entanto, a precisão dos relógios resistiu aos testes e causou repercussões na comunidade biomédica. Os cientistas começaram a usar relógios Horvath em suas pesquisas para medir o envelhecimento das células porque os relógios eram melhores árbitros do estado do corpo e do risco de doenças do que a idade cronológica. “Os relógios epigenéticos estão mais próximos do processo real de envelhecimento do que qualquer outro biomarcador”, disse Vadim Gladyshev, bioquímico do Brigham and Women's Hospital e da Harvard Medical School que estuda câncer e envelhecimento. Agora os relógios estão a levar alguns cientistas a repensar as suas ideias sobre o que é o envelhecimento, bem como a sua ligação às doenças.
“Agora tenho colaboradores que trabalham muito com o câncer de mama e [estão] começando a pensar: 'Se você tem envelhecimento biológico avançado, isso também é informativo para o câncer de mama?'” disse. Sara Hägg, epidemiologista molecular do Instituto Karolinska em Estocolmo, Suécia. Se os relógios puderem iluminar de forma útil como impedir que o processo de envelhecimento desencadeie doenças relacionadas com a idade, acrescentou ela, “poderíamos prevenir não apenas uma doença, mas muitas”.
Vendo um sinal
Repetidas vezes nas últimas décadas, os investigadores biológicos pensaram que um relógio para o envelhecimento estava ao nosso alcance. Por exemplo, eles aprenderam no início da década de 1960 que as células que crescem em cultura não são imortais, mas morrem após apenas 40-60 ciclos de replicação, o que sugere que as células abrigam uma espécie de relógio envelhecido. Em 1982, os investigadores pensaram que poderiam ter descoberto o mecanismo do relógio quando isolaram os telómeros, complexos de ADN-proteína nas extremidades dos cromossomas que encurtam cada vez que uma célula se divide; quando os telômeros ficam criticamente curtos, as células morrem.
Mas os telômeros não se transformaram em um relógio envelhecido. A correlação do comprimento dos telômeros com a idade e a mortalidade é fraca em humanos e inexistente em algumas outras espécies. “O [comprimento] do telômero na verdade não monitora a idade. Ele apenas rastreia a proliferação celular”, disse Ken Raj, investigador principal do Altos Labs.
Como alternativa ao comprimento dos telômeros, em 2009 Horvath começou a trabalhar em um relógio baseado nas transcrições de RNA dos genes ativos de uma célula, os modelos para as proteínas que definem uma célula e permitem que ela funcione. Nos dois anos seguintes, ele tentou fazer essa abordagem funcionar, sem sucesso: os dados da transcrição eram muito barulhentos.
Mas em 2010, Horvath respondeu a um pedido de ajuda de um colega da UCLA. Para estudar possíveis ligações entre orientação sexual e epigenética, o investigador recolheu saliva de gémeos idênticos que diferiam na orientação sexual, com a hipótese de que o ADN nas suas células salivares pudesse revelar algumas diferenças consistentes nos padrões de metilação. O irmão gêmeo de Horvath é gay; Horvath é heterossexual. Eles forneceram seu cuspe.
A análise do estudo analisou locais do DNA onde estão localizadas as bases da citosina e verificou quais delas estavam metiladas. (As citosinas são as únicas bases às quais os grupos metil se ligam.) Uma tecnologia de laboratório em chip recentemente introduzida facilitou o teste de dezenas de milhares de locais de citosina no DNA de cada célula. Quando o colega precisou de um estatístico para analisar os dados, Horvath ofereceu seus serviços voluntariamente.
Ele não encontrou o que procuravam. “Não houve nenhum sinal de homossexualidade”, disse Horvath. “Mas como os dados estavam no meu computador, eu disse, deixe-me analisar os efeitos do envelhecimento”, já que as idades dos gêmeos no estudo duraram décadas.
Até então, Horvath evitou dados epigenéticos em sua própria pesquisa. A relação dos padrões de metilação com a expressão genética é confusa e indireta, e parecia improvável que mostrasse uma ligação útil com o envelhecimento. Mas agora que ele tinha esses dados epigenéticos à sua disposição, não parecia haver mal nenhum em olhar.
Horvath começou a combinar os padrões de metilação com as idades dos gêmeos. Em qualquer amostra de saliva – ou em qualquer amostra de qualquer tecido – nem todas as células apresentarão o mesmo padrão de metilação. Mas a proporção de células que são metiladas em uma determinada citosina no DNA pode ser medida. Numa amostra, por exemplo, 40% das células podem estar metiladas numa determinada posição; em outro, essa proporção pode ser de 45% ou 60%.
Para sua surpresa, Horvath encontrou uma forte correlação entre a idade e a proporção de células com metilação, mesmo quando olhou apenas para um local do DNA. Olhar para mais locais aumentou a precisão.
“Isso mudou tudo para mim”, disse ele. “Assim que observei o sinal de envelhecimento, fiquei impressionado.”
Horvath construiu um modelo que previu a idade de uma pessoa do status de metilação de cerca de 300 citosinas em milhões de células em uma amostra de saliva. “Você cospe em um copo e podemos medir sua idade”, disse ele.
Logo ele estava construindo modelos de relógios epigenéticos para avaliar as idades biológicas do sangue, do fígado, do cérebro e de vários outros tecidos. Primeiro, ele mediu as proporções de células em cada amostra que apresentavam metilação em locais específicos. A partir desses dados, ele criou perfis dos tecidos que descreviam as proporções de células metiladas em cada local.
Para construir um relógio, ele alimentou um computador com milhares de perfis epigenéticos, juntamente com a idade de cada tecido perfilado. Através do aprendizado de máquina, o computador relacionou as idades aos padrões de metilação. Também reduziu o número de sites necessários para prever a idade. O computador então pesou a importância da metilação de cada local em seus cálculos para criar a melhor fórmula preditiva para a idade, que Horvath testou em um conjunto separado de amostras de idades conhecidas.
Em dois anos, ele combinou os relógios separados de envelhecimento dos tecidos em uma fórmula para um relógio “pan-tecido”, publicado em 2013. O relógio pan-tissue foi “a virada do jogo”, disse Daniel Belsky, epidemiologista da Escola de Saúde Pública Columbia Mailman. A fórmula aplicada a toda e qualquer célula humana contendo DNA. E qualquer um poderia usá-lo – Horvath colocou o software na internet. Ao carregar seus próprios dados de metilação, os biólogos puderam descobrir quanto tempo havia cobrado das células em suas amostras.
Quantificando o Declínio
O relógio pan-tecido de Horvath foi milagrosamente preciso na previsão da idade cronológica. Também parecia refletir importantes diferenças subjacentes entre a idade cronológica e a biológica. Os pesquisadores descobriram que quando o relógio epigenético estimava que a idade de alguém era maior que a idade cronológica, a pessoa enfrentava um risco maior de doença e morte. Quando o relógio estimou que alguém era mais jovem, o risco diminuiu. Embora o relógio epigenético tenha sido derivado de dados de idade cronológica, o seu algoritmo previu a mortalidade melhor do que a idade.
Assim, no final de 2014, Horvath decidiu monitorar explicitamente a idade biológica. Ele e seus colegas, incluindo Morgan Levin (um pesquisador de patologia da Universidade de Yale que recentemente ingressou no Altos Labs) e Luigi Ferrucci do Instituto Nacional do Envelhecimento, treinou um algoritmo em uma medida composta que incluía a idade cronológica, bem como os resultados de nove exames químicos do sangue que predizem doenças e mortalidade. Os dados vieram do sangue de mais de 9,900 adultos na Pesquisa Nacional de Exame de Saúde e Nutrição. O relógio resultante, DNAm PhenoAge, publicado em 2018, previu a mortalidade geral e o risco de doenças cardiovasculares, doenças pulmonares, cancro e diabetes, entre outros resultados. Um ano depois, Horvath e uma equipe liderada por Ake T. Lu, da UCLA, lançaram um preditor ainda mais preciso do tempo até a morte, Grim Age, que analisou o sexo, a idade cronológica, o histórico de tabagismo e os marcadores de mortalidade por proteínas do sangue de uma pessoa.
Uma nova ferramenta de Belsky e seus colegas, introduzida em 2020 e atualizada no início deste ano, atua como um velocímetro antigo. Ao criarem seus Ritmo de envelhecimento biomarcador, eles quantificaram a taxa de mudança em 19 marcadores de função de órgãos em quatro idades, compilaram-nos em um único índice e modelaram-no com metilação. “Na verdade, estamos quantificando o processo contínuo de declínio relacionado à idade e à integridade do sistema”, disse Belsky. Aqueles que envelhecem mais rápido com base nesta medida morrem mais jovens, disse ele, acrescentando que ela prevê a mortalidade tão bem quanto o GrimAge e pode prever ainda melhor o acidente vascular cerebral e a demência.
Pergunta antiga
Em 2017, representantes da Fundação da Família Paul G. Allen abordaram Horvath após uma de suas palestras. Gostaram do seu trabalho e sugeriram que sonhasse grande, porque a fundação apoia empreendimentos de alto risco. Encontre um projeto que ninguém mais financiaria, disseram eles.
Não demorou muito para Horvath sugerir um relógio antigo que se aplicasse a todos os vertebrados. A proposta foi aprovada – era bastante estranha – mas quando Horvath percebeu a magnitude do que envolveria, o plano transformou-se num relógio relativamente restrito para todos os mamíferos.
Em janeiro de 2021, Horvath tinha dados de metilação de 128 espécies de mamíferos, e ele postou seu relógio no servidor de pré-impressão biorxiv.org. “A mesma fórmula matemática, as mesmas citosinas para um camundongo, um rato, um cachorro ou um porco. Podemos medir o envelhecimento em todas essas espécies”, disse Horvath. Ainda assim, ele vasculhou o mundo em busca de mais.
No final do verão do ano passado, Horvath entrou em contato com Darren Pietersen, um especialista em pangolim do Fundação Tikki Hywood em Harare, no Zimbabué, oferecendo-lhe materiais para a recolha de dados sobre pangolins e diversas outras espécies. Ninguém sabia ao certo quanto tempo vivem os pangolins. Alguns relatos oficiais diziam de 15 a 20 anos, mas Pietersen achava que pelo menos alguns tipos vivem mais. “O único animal que envelhecemos recentemente tinha cerca de 34 anos (embora com uma margem de erro bastante ampla)”, escreveu ele.
A partir dos dados de tecido fornecidos, Horvath construiu um relógio pangolim, mais um cronômetro de vida para adicionar à sua coleção. “Você quer um relógio de porco, eu tenho um relógio de porco. Tenho um relógio para cangurus e elefantes”, disse Horvath. Cada relógio específico da espécie foi uma bênção para os cientistas da área. Os pesquisadores de elefantes, por exemplo, queriam o relógio dos elefantes para que pudessem determinar a estrutura etária das populações selvagens para ajudar nos esforços de conservação.
Mas um relógio que mescle todos eles pode ajudar a responder a uma pergunta mais básica: o que é o envelhecimento? Uma visão é que seu corpo envelhece como seus sapatos, desbotando gradualmente e se desfazendo com o uso. Mas as previsões bem-sucedidas do relógio pan-mamífero implicam que algo também faz com que as células falhem num determinado horário, talvez por causa de genes de desenvolvimento que não desligam quando o seu trabalho é concluído. “Isso sugere um elemento de determinismo no envelhecimento”, disse Raj, um dos mais de 100 construtores do relógio.
Os dados dos relógios de metilação sugerem que o envelhecimento começa muito cedo, muito antes de o corpo entrar em colapso. Em um papel 2021, Gladyshev e seus colegas descrevem um relógio de metilação que data os estágios do desenvolvimento dos mamíferos. Eles descobriram que durante o início da embriogênese em camundongos, uma espécie de rejuvenescimento reduz a idade do embrião a zero. O envelhecimento biológico prossegue então rapidamente, embora as crianças humanas estejam indiscutivelmente a ficar mais fortes, e não mais fracas, durante este período, e a mortalidade nos seres humanos diminui até cerca dos 9 anos. “Isso é para mim muito profundo porque prende esta questão do envelhecimento a um processo que é inextricável do processo de desenvolvimento”, disse Raj.
Dois estudos recentes sobre o rato-toupeira-pelado, um roedor com uma expectativa de vida improvávelmente longa de 37 anos, mostram que o animal envelhece epigeneticamente, embora as suas probabilidades de morrer não aumentem com a idade cronológica. “Acho que a taxa de mortalidade não é a melhor medida do envelhecimento”, disse Gladyshev, que liderou um dos estudos. “O envelhecimento é uma consequência inevitável de estar vivo.”
O envelhecimento ainda reflete os efeitos da experiência, do comportamento e do ambiente, é claro. Fumar e exposição ao sol, por exemplo, podem acelerá-lo, conforme medido pela metilação e outros marcadores, e o exercício ou uma dieta hipocalórica podem estancá-lo. Em trabalho publicado em março passado, um relógio epigenético adaptado para marmotas mostraram que a hibernação retarda o envelhecimento, e um papel publicado na semana passada mostrou que o mesmo se aplica aos morcegos. Um relógio feito para macacos rhesus sugere que em 2017 o furacão Maria acelerou o envelhecimento numa colónia de macacos numa ilha ao largo da costa de Porto Rico.
Pecado original
Ninguém sabe inteiramente por que os relógios funcionam. Alguns, mas não todos, genes e vias moleculares envolvidas foram identificados, e os investigadores ainda estão a aprender como os padrões de metilação afectam o comportamento e a saúde das células, tecidos e órgãos. “Isso remete ao que chamo de 'pecado original da construção'”, disse Horvath. “É baseado em um modelo de regressão [estatístico] que é, até certo ponto, agnóstico em relação à biologia.”
Para expiar este pecado, Raj e Horvath começaram a procurar correlatos biológicos para o envelhecimento epigenético. Perturbações das vias bioquímicas que o corpo utiliza para sentir a sua necessidade de nutrientes retardam o envelhecimento, descobriram recentemente, de acordo com os efeitos das dietas com restrição calórica no envelhecimento. Desviar o funcionamento das mitocôndrias acelera tudo. O relógio também acompanha a maturação das células-tronco. Se estes processos estiverem ligados a um nível mais profundo, os relógios epigenéticos podem revelar mecanismos unificadores para o envelhecimento, escreveram os autores num estudo de 2022. em papel Envelhecimento da Natureza.
Quais poderiam ser esses mecanismos unificadores ou por que o status de metilação acompanha tão bem o envelhecimento, no entanto, ainda não foi totalmente determinado. “Não sabemos realmente se os relógios epigenéticos estão causalmente ligados ao envelhecimento”, disse Hägg.
Mesmo que o sejam, é quase certo que os relógios epigenéticos medem apenas parte do que ocorre durante o envelhecimento, disse Matt Kaeberlein, pesquisador da Escola de Medicina da Universidade de Washington, em Seattle, que estuda a biologia do envelhecimento. “Não está claro se eles estão realmente medindo mais do que uma única dimensão da idade biológica”, disse ele. “Isso é parte do problema aqui – a fusão da idade epigenética com a idade biológica. Isso não é equivalente na minha opinião.”
Raj especula que as alterações na metilação refletem uma perda de identidade celular com a idade. Todas as células do corpo têm o mesmo DNA, então o que torna uma célula do fígado uma célula do fígado e uma célula do coração uma célula do coração é o padrão de expressão genética, que a epigenética controla. À medida que as alterações na metilação se acumulam com a idade, alguns desses controlos podem ser perdidos, substituídos por programas de desenvolvimento reemergentes que devem ser desligados, sugere Raj.
Embora os relógios de metilação possam ser os monitores mais precisos da idade biológica por enquanto, alguns estudos sugerem há espaço para melhorias. Um preditor mais preciso poderia combinar propriedades celulares quantificáveis – digamos, níveis de proteína, metabólito ou expressão genética – com sinais fisiológicos e um índice de fragilidade. “Podemos medir muitas coisas num ser humano agora”, disse Hägg. “Quanto mais dessas coisas você quantificar, com mais precisão você capturará seu envelhecimento.”
Os relógios de metilação também têm usos clínicos limitados, alertou Hägg. As pessoas podem comprar uma leitura da sua idade biológica a partir de várias fontes comerciais, mas não só os resultados são muitas vezes inconsistentes, como carecem de relevância clínica porque os relógios foram concebidos para análises a nível de grupo em investigação. “Eles não são construídos para serem preditivos em nível individual”, disse ela.
E mesmo que alguém mude o seu estilo de vida de uma forma que reduza a sua idade biológica medida por estes relógios, terá uma vida mais longa ou um risco menor de doenças? “Ainda não sabemos isso”, disse Kaeberlein.
Horvath está agora preparando um artigo sobre seu relógio pan-mamífero para ser submetido a uma revista. Embora ele aparentemente tenha alcançado seu objetivo, as lacunas em sua coleção ainda o incomodam. Em maio, ele se correspondeu com curadores seniores de um museu na Austrália sobre a aquisição de tecido de toupeiras marsupiais, uma criatura pequena e praticamente cega que passa a maior parte do tempo no subsolo. “Já geramos dados de 348 espécies de mamíferos, mas gostaríamos de acrescentar mais”, disse.
Quando Horvath propôs este projeto, ele decidiu analisar 30 espécies, mas 30 logo se tornaram 50, depois 100 e depois mais de três vezes isso. “Preciso me controlar”, disse ele, “porque tenho esse impulso de coletar mais”.
