Расширительная микроскопия позволяет получать наноизображения с помощью обычного микроскопа.

Расширительная микроскопия — это метод биологической визуализации, который позволяет визуализировать наноразмеры с использованием обычного флуоресцентного микроскопа с ограниченной дифракцией. Он работает, помещая образцы в набухающий в воде гидрогель, а затем расширяя гель. Это физически расширяет биомолекулы друг от друга, позволяя исследовать их с разрешением, ранее достижимым только с использованием дорогостоящих методов визуализации с высоким разрешением.

Однако текущие протоколы микроскопии расширения не оптимизированы для широкого применения. Образцы должны быть обработаны специальными фиксирующими агентами, чтобы связать определенные биомолекулы и метки с гидрогелем. Кроме того, в большинстве подходов достигается только примерно четырехкратное расширение ткани, что ограничивает эффективное разрешение примерно до 70 нм на обычном оптическом микроскопе с объективом с ограничением дифракции 280 нм.

Чтобы преодолеть эти недостатки, команда во главе с Университет Карнеги-Меллона разработала новую стратегию расширяющей микроскопии под названием Magnify. Протокол, описанный в Nature Biotechnology, использует новый механически прочный гидрогель, который сохраняет спектр биомолекул, не требуя отдельного этапа закрепления.

Функция Magnify может увеличивать образцы до 11 раз, позволяя визуализировать клетки и ткани с эффективным разрешением около 25 нм с помощью обычного микроскопа. В сочетании с визуализацией оптических флуктуаций сверхвысокого разрешения (SOFI, метод вычислительной постобработки) было достигнуто эффективное разрешение около 15 нм.

Предыдущие протоколы экспансивной микроскопии также требовали устранения многих биомолекул, удерживающих ткани вместе. «Чтобы сделать клетки действительно расширяемыми, вам нужно использовать ферменты для переваривания белков, поэтому в итоге у вас был пустой гель с метками, указывающими расположение интересующего белка», — объясняет старший автор. Юнсин Чжао В заявлении для прессы.

«Одним из основных преимуществ Magnify является универсальная стратегия сохранения биомолекул ткани, включая белки, нуклеиновые кислоты и углеводы, в расширенном образце. Молекулы остаются нетронутыми, и в одном образце можно пометить несколько типов биомолекул», — добавляет Чжао.

Широкие приложения

Чжао и его коллеги применили Magnify к широкому спектру типов тканей. Например, визуализация расширенного в 11 раз среза мозга мыши, окрашенного на предмет общего содержания белка, позволила визуализировать наноскопическую архитектуру отдельных синапсов в мозге. Magnify продемонстрировал эффективную разрешающую способность около 18 нм с использованием объектива × 60 (дифракционный предел около 200 нм).

Исследователи подтвердили низкое искажение, полученное с помощью протокола Magnify на нескольких типах тканей, с использованием предварительного расширения SOFI и пострасширения с помощью конфокальной микроскопии. Они не обнаружили существенных морфологических изменений между изображениями ядер клеток до и после расширения и белковых маркеров ни на макроскопическом, ни на субдифракционном уровнях.

Команда также протестировала Magnify на ряде фиксированных формалином образцов, залитых парафином, которые являются одними из самых важных препаратов для биопсии, но их сложно расширить с помощью текущих протоколов. Это включало срезы тканей почек, молочной железы, головного мозга и толстой кишки, а также соответствующие опухоли. Magnify может увеличить образцы примерно в 8.00–10.77 раз в воде, в зависимости от типа ткани.

Одной из ключевых целей было сделать Magnify подходящим для широкого спектра образцов тканей, облегчив его использование исследователями, стремящимися внедрить новый протокол. «Он работает с различными типами тканей, методами фиксации и даже с тканями, которые были сохранены и сохранены», — говорит соавтор. Брендан Галлахер. «Он очень гибкий, поскольку вам не обязательно полностью перепроектировать эксперименты с учетом Magnify; это будет работать с тем, что у вас уже есть».

Увеличение разрешения

Чтобы продемонстрировать дальнейшее увеличение эффективного разрешения, которое стало возможным благодаря сочетанию Magnify с SOFI, исследователи использовали эту комбинацию для визуализации органоидов легких человека, в частности ресничек, которые очищают дыхательные пути от слизи. При диаметре 200 нм и длине всего несколько микрометров эти структуры обычно слишком малы, чтобы их можно было увидеть без использования таких технологий, как электронная микроскопия (ЭМ).

Magnify-SOFI может полностью разрешить полую структуру ресничек и базальных тел, включая внешнее кольцо, ранее показанное EM как состоящее из девяти пучков микротрубочек. Исследователи оценили эффективное разрешение примерно в 14–17 нм (с использованием объектива с дифракционным ограничением 280 нм). Им также удалось визуализировать дефекты ресничек в клетках легких с генетическими мутациями.

Микроскопия сверхвысокого разрешения выявила механизм репликации коронавируса

«С помощью новейших методов Magnify мы можем расширить эти легочные ткани и начать видеть некоторую ультраструктуру подвижных ресничек даже с помощью обычного микроскопа, и это ускорит как базовые, так и клинические исследования», — комментирует соавтор. Си Рен.

Основываясь на успешной разработке Magnify, команда теперь использует его для изучения еще более сложных образцов тканей. «Это включает в себя изучение инфицированных тканей, а также более крупных образцов, таких как целые органы», — говорит Чжао. Мир физики. «Более того, мы работаем над оптимизацией Magnify для исследования патологических образцов человека и изучения наноразмерных изменений в мозге во время процессов обучения и заболеваний. Благодаря этим прорывам можно ожидать дальнейших открытий в этой многообещающей области исследований».

• SEO-контент и PR-распределение. Получите усиление сегодня.
• Платоблокчейн. Интеллект метавселенной Web3. Расширение знаний. Доступ здесь.
• Источник: https://physicsworld.com/a/expansion-microscopy-enables-nanoimaging-with-a-conventional-microscope/