Флуоресцентная микроскопия живых клеток является незаменимым инструментом для изучения динамики биологических систем. Но многие биологические процессы, такие как деление бактериальных клеток и деление митохондрий, например, происходят спорадически, что затрудняет их улавливание.
Непрерывная визуализация образца с высокой частотой кадров гарантирует, что, когда такие деления действительно произойдут, они обязательно будут записаны. Но чрезмерная флуоресцентная визуализация вызывает фотообесцвечивание и может преждевременно уничтожить живые образцы. В то же время более низкая частота кадров может привести к пропущенным интересующим событиям. Что необходимо, так это способ предсказать, когда должно произойти событие, а затем дать указание микроскопу начать высокоскоростную визуализацию.
Исследователи из Швейцарского федерального технологического института Лозанны (г.EPFL) создали именно такую систему. Команда разработала структуру сбора данных, управляемую событиями (EDA), которая автоматизирует управление микроскопом для детального отображения биологических событий, ограничивая нагрузку на образец. Используя нейронные сети для обнаружения малозаметных предвестников интересующих событий, EDA адаптирует параметры сбора данных, такие как скорость визуализации или продолжительность измерения, в ответ.
«Умный микроскоп похож на беспилотный автомобиль. Ему необходимо обрабатывать определенные типы информации, тонкие паттерны, на которые он затем реагирует, изменяя свое поведение», — объясняет главный исследователь. Сулиана Мэнли в заявлении для прессы. «Используя нейронную сеть, мы можем обнаруживать гораздо более тонкие события и использовать их для изменения скорости сбора данных».
Структура EDA, описанная в Методы природы, состоит из петли обратной связи между потоком изображения в реальном времени и элементами управления микроскопом. Исследователи использовали программное обеспечение Micro-Manager для захвата изображений с микроскопа и нейронную сеть, обученную на размеченных данных для их анализа. Для каждого изображения выходные данные сети действуют как параметр принятия решения для переключения между медленной и быстрой визуализацией.
Распознавание событий
Чтобы продемонстрировать свою новую технику, Мэнли и его коллеги интегрировали EDA в микроскоп мгновенного структурированного освещения и использовали его для захвата замедленных видеороликов со сверхвысоким разрешением митохондриальных и бактериальных делений.
Митохондриальное деление непредсказуемо, обычно происходит раз в несколько минут и длится десятки секунд. Чтобы предсказать начало деления, команда обучила нейронную сеть обнаруживать сужения, изменение формы митохондрий, приводящее к делению, в сочетании с наличием белка DRP1, необходимого для спонтанного деления.
Нейронная сеть выводит тепловую карту «оценок событий» с более высокими значениями (когда высоки как сужения, так и уровни DRP1), указывающими места на изображении, где с большей вероятностью произойдет разделение. Как только оценка события превышает пороговое значение, скорость визуализации увеличивается для подробного захвата событий деления. Как только оценка снижается до второго порогового значения, микроскоп переключается на низкоскоростную визуализацию, чтобы избежать чрезмерного освещения образца.
Исследователи выполнили EDA на клетках, экспрессирующих флуоресцентные метки, нацеленные на митохондрии. Во время каждого измерения EDA сеть распознавала предшественников бактериального деления в среднем девять раз. Это переключало скорость изображения с медленной (0.2 кадра/с) на высокую (3.8 кадра/с) в среднем на 10 с, что приводило к быстрой визуализации для 18% кадров. Они отмечают, что многие сайты накапливали DRP1, но не приводили к разделению. Эти сайты не запускали сеть, демонстрируя ее способность различать интересующие события.
Для сравнения команда также собирала изображения с постоянной медленной и быстрой скоростью. EDA вызывает меньшее фотообесцвечивание образца, чем быстрая визуализация с фиксированной скоростью, что позволяет дольше наблюдать за каждым образцом и увеличивает вероятность захвата редких событий митохондриального деления. В некоторых случаях образец восстанавливался после фотообесцвечивания на этапах медленной визуализации, что позволяло получить более высокую кумулятивную дозу света.
Хотя обесцвечивание было выше при использовании EDA, чем при постоянной медленной визуализации, многие сеансы EDA достигали 10 минут без ухудшения состояния образца. Исследователи также обнаружили, что EDA лучше разрешила сужения, предшествующие делению, а также развитие состояний мембраны, ведущее к делению, как было зафиксировано во вспышках быстрых изображений.
«Потенциал интеллектуальной микроскопии включает измерение того, что упускают из виду стандартные измерения», — объясняет Мэнли. «Мы фиксируем больше событий, измеряем меньшие ограничения и можем более подробно отслеживать каждое подразделение».
Обнаружение бактериального деления
Затем исследователи использовали EDA для изучения деления клеток у бактерий. С. полумесяц. Бактериальный клеточный цикл занимает десятки минут, что создает определенные проблемы для микроскопии живых клеток. Они собирали данные с низкой скоростью изображения 6.7 кадра в час, с высокой скоростью изображения 20 кадров в час или с переменной скоростью, переключаемой EDA.
Команда обнаружила, что сеть обнаружения событий, разработанная для митохондриальных перетяжек, может распознавать заключительные стадии бактериального деления без дополнительного обучения — вероятно, из-за сходства формы перетяжки и наличия функционально подобного молекулярного маркера.
Усовершенствованный метод микроскопии позволяет видеть живые клетки с в семь раз большей чувствительностью
Опять же, EDA уменьшил фотообесцвечивание по сравнению с постоянной быстрой визуализацией и измерил сужения со значительно меньшим средним диаметром, чем с постоянной медленной визуализацией. EDA позволил визуализировать весь клеточный цикл и предоставил детали деления бактериальных клеток, которые трудно зафиксировать с использованием фиксированной скорости визуализации..
Мэнли рассказывает Мир физики что команда также планирует обучать нейронные сети обнаруживать различные виды событий и использовать их для вызова различных аппаратных ответов. «Например, мы предполагаем использовать оптогенетические возмущения для модуляции транскрипции в ключевые моменты дифференцировки клеток», — объясняет она. «Мы также думаем об использовании обнаружения событий в качестве средства сжатия данных, выбирая для хранения или анализа фрагменты данных, которые наиболее важны для данного исследования».
- Чтобы позволить исследователям реализовать EDA на самых разных микроскопах, команда предоставляет структуру управления в качестве плагин с открытым исходным кодом для программного обеспечения Micro-Manager.
