'Lobi', kjer molekularna mafija genom govori, kaj naj naredijo | Revija Quanta

Odkritje med projektom človeškega genoma v zgodnjih 2000-ih, da imamo ljudje le okoli 20,000 genov, ki kodirajo beljakovine – približno toliko kot drobne v tleh živeče ogorčice in manj kot polovico manj kot riževa rastlina – je bilo šokantno. . Ta udarec našemu ponosu pa je omilila ideja, da je človeški genom bogat z regulativnimi povezavami. Naši geni medsebojno delujejo v gosti mreži, v kateri deli DNA in molekule, ki jih kodirajo (RNA in proteini), nadzorujejo "izražanje" drugih genov, kar vpliva na to, ali tvorijo svojo RNK in beljakovine. Da bi razumeli človeški genom, smo morali razumeti ta proces regulacije genov.

Vendar se ta naloga izkaže za veliko težjo od dekodiranja zaporedja genoma.

Sprva se je sumilo, da je regulacija genov preprosta stvar enega genskega produkta, ki deluje kot stikalo za vklop/izklop drugega gena, na digitalni način. V šestdesetih letih prejšnjega stoletja sta francoska biologa François Jacob in Jacques Monod prva razjasnila proces genske regulacije v mehaničnih podrobnostih: In Escherichia coli bakterije, ko se represorski protein veže na določen segment DNA, blokira transkripcijo in prevod sosednjega sklopa genov, ki kodirajo encime za prebavo sladkorja laktoze. Ta regulacijski krog, ki sta ga Monod in Jacob poimenovala jezero operon, ima lepo, pregledno logiko.

Vendar se zdi, da regulacija genov v kompleksnih metazoanih - živalih, kot so ljudje, s kompleksnimi evkariontskimi celicami - na splošno ne deluje tako. Namesto tega vključuje skupino molekul, vključno z beljakovinami, RNK in deli DNK iz celega kromosoma, ki nekako sodelujejo pri nadzoru izražanja gena.

Ne gre le za to, da ima ta regulacijski proces pri evkariontih več igralcev, kot jih običajno opazimo pri bakterijah in drugih preprostih prokariontskih celicah; zdi se, da je to kategorično drugačen proces in bolj nejasen.

Ekipa na univerzi Stanford, ki jo vodita biofizik in bioinženir Polly Fordyce, se zdi, da je zdaj odkril komponento tega mehkega načina regulacije genov. Njihovo delo, objavljeno septembra lani v Znanost, nakazuje, da DNK v bližini gena deluje kot nekakšen plitvi vodnjak za lovljenje različnih regulatornih molekul, ki jih ohranja pripravljene za delovanje, tako da lahko po potrebi dodajo svoj glas k odločitvi o tem, ali naj aktivirajo gen.

Ti regulacijski vodnjaki so izdelani iz izrazito nenavadnih odsekov DNK. Sestavljeni so iz zaporedij, v katerih se kratek odsek DNK, dolg od enega do šest baznih parov, večkrat ponovi. Na desetine kopij teh "kratkih tandemskih ponovitev" (STR) je mogoče nanizati skupaj v teh zaporedjih, kot vedno znova napisana ista majhna "beseda".

STR je v človeškem genomu veliko: obsegajo približno 5 % vse naše DNK. Nekoč so veljali za klasične primere »smeti« DNK, ker ponavljajoče se »besedilo« DNK, sestavljeno samo iz STR-jev, ne more vsebovati niti približno toliko pomembnih informacij kot na primer nepravilno zaporedje črk, ki sestavljajo stavek v tem Članek.

In vendar STR očitno niso nepomembne: povezujejo jih z boleznimi, kot so Huntingtonova bolezen, spinobulbarna mišična atrofija, Crohnova bolezen in nekateri raki. V zadnjih nekaj desetletjih so se nabrali dokazi, da lahko nekako izboljšajo ali zavirajo regulacijo genov. Skrivnost je bila, kako so lahko tako močni s tako malo vsebine informacij.

Kompleksne kontrole za kompleksne celice

Da bi razumeli, kako se STR-ji prilegajo veliki sliki regulacije genov, stopimo korak nazaj. Geni so rutinsko obkroženi z deli DNK, ki ne kodirajo RNK ali beljakovin, imajo pa regulativne funkcije. Bakterijski geni imajo "promotorske" regije, kjer se lahko vežejo encimi polimeraze, da začnejo prepisovanje sosednje DNK v RNK. Prav tako imajo rutinsko "operatorske" regije, kjer se lahko represorski proteini vežejo in blokirajo transkripcijo ter izklopijo gen, kot v jezero operon.

Pri ljudeh in drugih evkariontih so regulativna zaporedja lahko številčnejša, raznolika in zapletena. Regije, imenovane ojačevalci, na primer vplivajo na verjetnost, da bo gen prepisan. Ojačevalci so pogosto tarče za beljakovine, imenovane transkripcijski faktorji, ki se lahko vežejo in povečajo ali zavirajo izražanje genov. Nenavadno je, da so nekateri ojačevalci na desettisoče baznih parov oddaljeni od genov, ki jih uravnavajo, in se jim približajo le s fizično preureditvijo zank DNK v pakiranem kromosomu.

Regulacija evkariontskih genov običajno vključuje te številne različne regulativne bloke DNK, skupaj z enim ali več transkripcijskimi faktorji in drugimi molekulami, vsi pa se zbirajo okoli gena, kot je odbor, sklican, da se odloči, kaj naj naredi. Združujejo se v ohlapen, gost grozd.

Pogosto se tudi zdi, da molekularni udeleženci ne sodelujejo prek visoko selektivnih parov »ključavnica in ključ«, ki so običajni v molekularni biologiji. Namesto tega so veliko manj izbirčni, komunicirajo precej šibko in neselektivno, kot da tavajo naokoli in začenjajo kratke pogovore drug z drugim.

Pravzaprav je bilo skrivnost, kako se transkripcijski faktorji vežejo na DNK pri evkariontih. Dolgo se je domnevalo, da se mora del transkripcijskega faktorja tesno ujemati z zaporedjem veznega "motiva" v DNK, kot kosi sestavljanke. Toda čeprav so bili nekateri taki motivi identificirani, njihova prisotnost ni vedno dobro povezana s tem, kje znanstveniki najdejo transkripcijske faktorje, ki se držijo DNK v celicah. Včasih se transkripcijski faktorji zadržujejo v regijah brez kakršnih koli motivov, nekateri motivi, za katere se zdi, da bi morali močno vezati transkripcijske faktorje, pa ostanejo prazni.

"Tradicionalno v genomiki je bil cilj razvrstiti genomska mesta na [binaren] način kot 'vezana' ali 'nevezana'" s transkripcijskimi faktorji, je dejal Fordyce. "Toda slika je veliko bolj niansirana." Zdi se, da posamezni člani teh "odborov" za gensko regulacijo niso vedno prisotni ali odsotni na svojih sestankih, temveč imajo različne možnosti, da bodo tam ali ne.

Nagnjenost k regulaciji genov pri evkariontih, da se zanašajo na toliko raznolikih šibkih interakcij med velikimi molekularnimi kompleksi, je "ena od stvari, zaradi katerih je teoretično težko razumeti," je dejal biofizik. Thomas Kuhlman s kalifornijske univerze v Riversideu, ki je napisal komentar na papirju laboratorija Fordyce za Znanost. Globoka uganka je, kako se iz tega na videz kaotičnega procesa pojavijo natančne odločitve o vklopu in izklopu genov.

Poleg skrivnostne mehke logike tega odločitvenega procesa obstaja tudi vprašanje, kako vsi člani odbora sploh najdejo pot do prave sobe – in potem tam ostanejo. Molekule se na splošno premikajo po celici z difuzijo, udarjajo jih vse druge okoliške molekule, kot je voda, in tavajo v naključnih smereh. Lahko bi pričakovali, da se bodo ti ohlapni odbori prehitro razšli, da bi opravljali svoje regulativno delo.

Fordyce in njeni sodelavci menijo, da je to tisto, kar pride na vrsto STR. STR so presenetljivo pogosti na ojačevalnih mestih na DNK. V svojem prispevku raziskovalci trdijo, da STR-ji delujejo kot lepljivi obliži, ki zbirajo transkripcijske faktorje in jim preprečujejo, da bi zašli.

Natančna nastavitev lepljivosti

Fordyceova skupina je sistematično raziskovala, kako razlike v zaporedju STR vplivajo na lepljenje transkripcijskih faktorjev na vezni motiv. Pregledali so dva dejavnika - enega od kvasovk, enega od ljudi - ki se držita določenega motiva šestih baz. Raziskovalci so izmerili moč (ali afiniteto) te vezave in hitrost, s katero se transkripcijski faktorji zataknejo in odlepijo (kinetika), ko je motiv obdan s STR namesto naključnega zaporedja. Za primerjavo so pogledali, kako hitro se dejavniki vežejo samo na STR in na povsem naključno zaporedje DNK.

"Eden največjih izzivov tega področja je ločiti nešteto spremenljivk, ki vplivajo na vezavo [transkripcijskega faktorja] na določenem mestu genoma," je dejal David Suter, molekularni biolog na švicarskem zveznem inštitutu za tehnologijo Lausanne v Švici. Oblika DNK, bližina drugih segmentov DNK in fizična napetost v molekulah DNK lahko igrajo vlogo pri vezavi transkripcijskega faktorja. Vrednosti teh parametrov se verjetno razlikujejo na vsakem mestu v genomu in morda tudi med tipi celic in znotraj posamezne celice skozi čas na danem mestu. "To je ogromen prostor neznanih spremenljivk, ki jih je zelo težko kvantificirati," je dejal Suter.

Zato so dobro nadzorovani poskusi, kot so tisti Stanfordove ekipe, tako uporabni, je dodal Kuhlman. Običajno imajo raziskovalci, ko morajo izmeriti šibke interakcije, kot je ta, dve možnosti: opravijo lahko nekaj zelo podrobnih, izjemno natančnih meritev in jih posplošijo ali pa opravijo veliko hitrih in umazanih meritev in uporabijo matematično zapletene statistične metode za izpeljavo rezultatov. Toda Fordyce in njeni kolegi so po besedah ​​Kuhlmana uporabili avtomatiziran postopek, ki temelji na mikrofluidnem čipu, da bi med visoko zmogljivimi poskusi opravili natančne meritve, "da bi dobili najboljše iz obeh svetov."

Stanfordska ekipa je ugotovila, da lahko različna zaporedja STR spremenijo afinitete vezave transkripcijskih faktorjev na DNK kar za faktor 70; imajo včasih večji vpliv na vezavo transkripcijskega faktorja kot spreminjanje zaporedja samega veznega motiva. In učinki so bili različni za dva različna transkripcijska faktorja, ki so ju gledali.

Zdi se torej, da lahko STR natančno prilagodijo sposobnost transkripcijskih faktorjev, da se priklopijo na mesto DNK in tako regulirajo gen. Toda kako točno?

Čakalnica blizu gen

Raziskovalci so ugotovili, da lahko del transkripcijskega faktorja, ki veže DNA, šibko vpliva na STR, pri čemer je natančna moč te afinitete odvisna od zaporedja STR. Ker je taka vezava šibka, ne bo imela veliko specifičnosti. Če pa transkripcijski faktor znova in znova ohlapno zagrabi in sprošča STR, je kumulativni učinek ohranjanje transkripcijskega faktorja v bližini gena, tako da je bolj verjetno, da se bo po potrebi varno vezal na motivno regijo.

Fordyce in njeni kolegi so napovedali, da STR-ji tako delujejo kot "lobi" ali vodnjak, kjer se lahko transkripcijski faktorji zberejo, čeprav prehodno, v bližini regulativnega vezavnega mesta. "Ponavljajoča se narava STR poveča šibek učinek katerega koli posameznega vezavnega mesta, iz katerega je sestavljena," je dejal Connor Horton, prvi avtor študije, ki je zdaj doktorski študent na kalifornijski univerzi Berkeley.

Nasprotno, dodal je, lahko nekatere STR delujejo tudi tako, da potegnejo transkripcijske faktorje stran od regulativnih sekvenc, pri čemer transkripcijske faktorje vpijejo drugje kot goba. Na ta način lahko zavirajo izražanje genov.

Delo, je dejal Suter, "prepričljivo kaže, da STR neposredno vplivajo na vezavo transkripcijskih faktorjev in vitro." Še več, skupina Stanford je uporabila algoritem strojnega učenja, da bi pokazala, da se zdi, da se učinki, opaženi v njihovih in vitro poskusih, pojavljajo tudi v živih celicah (to je in vivo).

Ampak Robert Tjan, biokemik na Berkeleyju in raziskovalec na medicinskem inštitutu Howard Hughes, meni, da je morda še prezgodaj, da bi bili prepričani, kakšen vpliv ima kombinacija STR-transkripcijskih faktorjev na izražanje genov v resničnih celicah.

Tjian, Xavier Darzacq in njihovi kolegi v laboratoriju, ki ga skupaj vodijo na Berkeleyju, se strinjajo, da se zdi, da STR ponujajo način koncentracije transkripcijskih faktorjev v bližini genskih regulatornih mest. Ne da bi vedeli, kako blizu morajo biti dejavniki za aktiviranje transkripcije, je težko razumeti funkcionalni pomen tega rezultata. Tjian je rekel, da bi rad videl, ali uvedba STR v živo celico predvidljivo vpliva na izražanje ciljnega gena. Trenutno, je dejal, "ni prepričan, da bodo STR-ji nujno pomemben vidik [regulativnih] mehanizmov in vivo."

Kombinatorna slovnica

Ena dolgotrajna uganka je, kako takšen mehanizem zanesljivo zagotavlja vrsto natančne genske regulacije, ki jo potrebujejo celice, saj sta tako moč kot selektivnost vezave transkripcijskega faktorja v vdolbinicah STR šibki. Fordyce meni, da bi taka specifičnost vpliva lahko izhajala iz številnih virov - ne samo iz razlik v sekvencah STR, ampak tudi iz kooperativnih interakcij med transkripcijskimi faktorji in drugimi proteini, ki sodelujejo pri regulaciji.

Glede na vse to, je dejal Horton, ni jasno, ali bo enostavno napovedati učinek dane kombinacije STR-transkripcijskih faktorjev na izražanje gena. Logika procesa je res nejasna. In "slovnica" vpliva je verjetno kombinatorna, je dodal Horton: rezultat je odvisen od različnih kombinacij transkripcijskih faktorjev in drugih molekul.

Stanfordska ekipa meni, da je morda 90 % transkripcijskih faktorjev občutljivih na STR, vendar je v človeškem genomu veliko več vrst transkripcijskih faktorjev kot vrst STR. "Mutacija zaporedja STR lahko vpliva na vezavo 20 različnih transkripcijskih faktorjev v tem tipu celic, kar vodi do splošnega zmanjšanja transkripcije tega bližnjega gena, ne da bi vplivalo na kateri koli specifični transkripcijski faktor," je dejal Horton.

Stanfordska ekipa se torej strinja s Tjianom, da regulacije genov v živih celicah ne bo vodil en sam preprost mehanizem. Namesto tega se lahko transkripcijski faktorji, njihova vezavna mesta za DNA in druge regulativne molekule zberejo v gosta zbiranja, ki skupno izvajajo svoj vpliv.

"Zdaj obstaja več primerov, ki podpirajo zamisel, da lahko elementi DNK množijo transkripcijske faktorje do točke, ko tvorijo kondenzate s kofaktorji," je dejal. Richard Young, celični biolog na Inštitutu Whitehead Tehnološkega inštituta v Massachusettsu. Ojačevalci vežejo številne transkripcijske faktorje, da ustvarijo to gnečo. STR-ji so lahko sestavina, ki pomaga zbrati transkripcijske faktorje v skupine v bližini gena, vendar ne bodo vsa zgodba.

Zakaj regulirati gene na tako zapleten način, namesto da bi se zanašal na vrste močnih in specifičnih interakcij med regulativnimi proteini in mesti DNK, ki prevladujejo v prokariontih? Možno je, da je taka nejasnost tisto, zaradi česar so veliki kompleksni metazoji sploh mogoči.

Da bi bili organizmi sposobni preživetja, morajo biti sposobni razvijati se in se prilagajati spreminjajočim se okoliščinam. Če bi se naše celice zanašale na neko ogromno, a strogo predpisano mrežo interakcij genskih regulatorjev, bi jo bilo težko spremeniti, ne da bi porušili celotno napravo, tako kot bo švicarska ura zaskočila, če odstranimo (ali celo rahlo premaknemo) kakršno koli njegovih neštetih zobnikov. Če pa so regulativne molekularne interakcije ohlapne in precej nespecifične, je v sistemu koristna ohlapnost - tako kot lahko odbor na splošno sprejme dobro odločitev, tudi če je eden od njegovih članov bolan.

Fordyce ugotavlja, da je pri prokariontih, kot so bakterije, lahko transkripcijski faktorji razmeroma enostavno najti svoja vezavna mesta, ker je genom, ki ga je treba iskati, manjši. Toda to postane težje, ko se genom poveča. V velikih genomih evkariontov "ne morete več prenašati tveganja, da boste začasno obtičali na 'napačnem' mestu vezave," je dejal Fordyce, ker bi to ogrozilo sposobnost hitrega odzivanja na spreminjajoče se okoljske razmere.

Poleg tega se STR same zelo razvijajo. Podaljšanje ali skrajšanje njihovega zaporedja ali sprememba velikosti in globine "vdolbinice transkripcijskega faktorja" se lahko zlahka pojavi zaradi napak pri replikaciji ali popravljanju DNK ali zaradi spolne rekombinacije kromosomov. Fordyceu nakazuje, da STR-ji "lahko zato služijo kot surovina za razvijanje novih regulativnih elementov in fino prilagajanje obstoječih regulativnih modulov za občutljive transkripcijske programe," kot so tisti, ki urejajo razvoj živali in rastlin.

Moč šibkih interakcij

Takšna razmišljanja vodijo molekularne biologe, da posvečajo veliko več pozornosti šibkim in razmeroma neselektivnim interakcijam v genomu. Mnogi od njih vključujejo beljakovine, ki so, namesto da bi imele fiksno in natančno strukturo, ohlapne in mehke - "intrinzično neurejene", kot pravijo biokemiki. Če bi beljakovine delovale le skozi toge strukturne domene, je pojasnil Young, bi to omejilo ne le, kako dobro bi se lahko razvili regulativni sistemi, ampak tudi vrste dinamične regulacije, ki jih vidimo v življenju. "Ne boste našli živega organizma - ali celo virusa - ki bi deloval samo s stabilnimi strukturnimi elementi, kot so tisti v švicarski uri," je dejal Young.

Morda je evolucija le naletela na STR kot sestavni del tako kompleksne, a navsezadnje učinkovitejše rešitve za regulacijo genov pri evkariontih. Same STR se lahko pojavijo na več načinov - na primer zaradi napak pri replikaciji DNK ali dejavnosti segmentov DNK, imenovanih prenosljivi elementi, ki sami sebe kopirajo po celotnem genomu.

"Zgodilo se je, da so bile nastale šibke interakcije med proteini in ponavljajočimi se sekvencami nekaj, kar bi lahko … zagotovilo selektivno prednost celicam, kjer se je to zgodilo," je dejal Kuhlman. Njegovo ugibanje je, da je bila ta nejasnost verjetno vsiljena evkariontom, a da so jo "pozneje lahko izkoristili za lastno korist." Bakterije in drugi prokarionti se lahko zanašajo na dobro definirano "digitalno" regulativno logiko, ker njihove celice običajno obstajajo le v nekaj preprostih, ločenih stanjih, kot je premikanje in razmnoževanje.

Toda različna celična stanja za metazoe so "veliko bolj zapletena in včasih blizu kontinuuma," je dejal Suter, zato jim bolje služi mehka "analogna" regulacija.

"Zdi se, da so se sistemi genske regulacije v bakterijah in evkariontih precej razlikovali," se je strinjal Tjian. Medtem ko naj bi Monod nekoč pripomnil, da »kar velja za E. coli velja za slona,” se zdi, da ni vedno tako.