กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ของเซลล์ที่มีชีวิตเป็นเครื่องมือที่ขาดไม่ได้ในการศึกษาพลวัตของระบบชีววิทยา แต่กระบวนการทางชีววิทยาหลายอย่าง เช่น การแบ่งเซลล์แบคทีเรียและการแบ่งไมโตคอนเดรีย เกิดขึ้นเป็นระยะๆ ทำให้ยากต่อการจับ
การถ่ายภาพตัวอย่างอย่างต่อเนื่องที่อัตราเฟรมสูงจะช่วยให้มั่นใจได้ว่าเมื่อการแบ่งส่วนดังกล่าวเกิดขึ้น การแบ่งส่วนดังกล่าวจะถูกบันทึกไว้อย่างแน่นอน แต่การถ่ายภาพเรืองแสงที่มากเกินไปทำให้เกิดการฟอกสีด้วยแสงและสามารถทำลายตัวอย่างที่มีชีวิตก่อนเวลาอันควรได้ อัตราเฟรมที่ช้าลงก็เสี่ยงที่จะพลาดเหตุการณ์ที่น่าสนใจ สิ่งที่จำเป็นคือวิธีการทำนายว่าเหตุการณ์หนึ่งจะเกิดขึ้นเมื่อใด จากนั้นจึงสั่งให้กล้องจุลทรรศน์เริ่มถ่ายภาพด้วยความเร็วสูง
นักวิจัยจากสถาบันเทคโนโลยีแห่งสหพันธรัฐสวิส โลซาน (EPFL) ได้สร้างระบบดังกล่าวขึ้นมา ทีมงานได้พัฒนากรอบการทำงานที่ขับเคลื่อนด้วยเหตุการณ์ (EDA) ซึ่งจะทำให้การควบคุมด้วยกล้องจุลทรรศน์อัตโนมัติเพื่อแสดงภาพเหตุการณ์ทางชีววิทยาโดยละเอียด ในขณะเดียวกันก็จำกัดความเครียดในตัวอย่าง การใช้โครงข่ายประสาทเทียมเพื่อตรวจจับสารตั้งต้นที่ละเอียดอ่อนของเหตุการณ์ที่สนใจ EDA จะปรับพารามิเตอร์การรับข้อมูล เช่น ความเร็วของภาพหรือระยะเวลาในการวัด เพื่อตอบสนอง
“กล้องจุลทรรศน์อัจฉริยะก็เหมือนกับรถยนต์ที่ขับเคลื่อนด้วยตนเอง มันจำเป็นต้องประมวลผลข้อมูลบางประเภท รูปแบบที่ละเอียดอ่อนที่จะตอบสนองโดยการเปลี่ยนพฤติกรรม” ผู้ตรวจสอบหลักอธิบาย ซูเลียนา แมนลีย์ ในแถลงการณ์ “ด้วยการใช้โครงข่ายประสาทเทียม เราสามารถตรวจจับเหตุการณ์ที่ละเอียดอ่อนได้มากขึ้น และใช้เหตุการณ์เหล่านี้เพื่อขับเคลื่อนการเปลี่ยนแปลงความเร็วในการรับข้อมูล”
กรอบการทำงานของ EDA ดังที่อธิบายไว้ใน วิธีธรรมชาติประกอบด้วยลูปป้อนกลับระหว่างสตรีมภาพสดและส่วนควบคุมกล้องจุลทรรศน์ นักวิจัยใช้ซอฟต์แวร์ Micro-Manager เพื่อจับภาพจากกล้องจุลทรรศน์และโครงข่ายประสาทเทียมที่ได้รับการฝึกอบรมเกี่ยวกับข้อมูลที่ติดป้ายกำกับเพื่อวิเคราะห์ สำหรับแต่ละภาพ เอาต์พุตเครือข่ายทำหน้าที่เป็นพารามิเตอร์ในการตัดสินใจเพื่อสลับระหว่างการถ่ายภาพช้าและเร็ว
การรับรู้เหตุการณ์
เพื่อสาธิตเทคนิคใหม่ของพวกเขา Manley และเพื่อนร่วมงานได้รวม EDA เข้ากับกล้องจุลทรรศน์ส่องสว่างแบบมีโครงสร้างแบบทันที และใช้มันเพื่อจับภาพภาพยนตร์เหลื่อมเวลาที่ได้รับการแก้ไขขั้นสูงของการแบ่งไมโตคอนเดรียและแบคทีเรีย
การแบ่งไมโตคอนเดรียเป็นสิ่งที่คาดเดาไม่ได้ โดยทั่วไปจะเกิดขึ้นทุกๆ สองสามนาทีและยาวนานหลายสิบวินาที เพื่อทำนายการเริ่มต้นของการแบ่งตัว ทีมงานได้ฝึกโครงข่ายประสาทเทียมเพื่อตรวจจับการหดตัว การเปลี่ยนแปลงรูปร่างของไมโตคอนเดรียที่นำไปสู่การแบ่งตัว รวมกับการมีโปรตีนที่เรียกว่า DRP1 ซึ่งจำเป็นสำหรับการแบ่งตัวที่เกิดขึ้นเอง
โครงข่ายประสาทเทียมจะส่งออกแผนที่ความร้อนของ “คะแนนเหตุการณ์” โดยมีค่าที่สูงกว่า (เมื่อทั้งการหดตัวและระดับ DRP1 สูง) ระบุตำแหน่งภายในภาพที่มีแนวโน้มที่จะเกิดการแบ่งตัวมากขึ้น เมื่อคะแนนเหตุการณ์เกินค่าเกณฑ์ ความเร็วในการถ่ายภาพจะเพิ่มขึ้นเพื่อบันทึกเหตุการณ์การแบ่งส่วนโดยละเอียด เมื่อคะแนนลดลงถึงเกณฑ์ที่สอง กล้องจุลทรรศน์จะสลับไปที่การถ่ายภาพความเร็วต่ำเพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้ตัวอย่างสัมผัสกับแสงที่มากเกินไป
นักวิจัยได้ดำเนินการ EDA กับเซลล์ที่แสดงฉลากเรืองแสงที่มีเป้าหมายเป็นไมโตคอนเดรีย ในระหว่างการวัด EDA แต่ละครั้ง เครือข่ายจะจดจำสารตั้งต้นในการแบ่งตัวของแบคทีเรียโดยเฉลี่ยเก้าครั้ง ซึ่งสลับความเร็วในการถ่ายภาพจากช้า (0.2 เฟรม/วินาที) ไปเป็นเร็ว (3.8 เฟรม/วินาที) เป็นเวลาเฉลี่ย 10 วินาที ส่งผลให้ได้การถ่ายภาพที่รวดเร็วถึง 18% ของเฟรม พวกเขาทราบว่าไซต์จำนวนมากสะสม DRP1 แต่ไม่ได้นำไปสู่การแบ่งแยก ไซต์เหล่านี้ไม่ได้กระตุ้นเครือข่าย ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการแยกแยะเหตุการณ์ที่สนใจ
เพื่อการเปรียบเทียบ ทีมงานยังได้รวบรวมภาพที่ความเร็วช้าและเร็วคงที่ EDA ทำให้เกิดการฟอกสีด้วยแสงตัวอย่างน้อยกว่าการถ่ายภาพด้วยอัตราเร็วคงที่ ทำให้สามารถสังเกตตัวอย่างแต่ละตัวอย่างได้นานขึ้น และเพิ่มโอกาสที่จะจับภาพเหตุการณ์การแบ่งไมโตคอนเดรียซึ่งพบได้ยาก ในบางกรณี ตัวอย่างจะฟื้นตัวจากการฟอกด้วยแสงในระหว่างขั้นตอนการถ่ายภาพที่ช้า ซึ่งช่วยให้ได้รับปริมาณแสงสะสมที่สูงขึ้น
แม้ว่าการฟอกสีด้วย EDA จะสูงกว่าการถ่ายภาพช้าอย่างต่อเนื่อง แต่เซสชัน EDA หลายครั้งใช้เวลาถึง 10 นาทีโดยไม่ทำให้สุขภาพตัวอย่างลดลง นักวิจัยยังพบว่า EDA สามารถแก้ไขการหดตัวก่อนการแบ่งตัวได้ดีขึ้น เช่นเดียวกับการลุกลามของสถานะของเมมเบรนที่นำไปสู่การเกิดฟิชชัน ดังที่บันทึกโดยการระเบิดของภาพที่รวดเร็ว
Manley อธิบาย "ศักยภาพของกล้องจุลทรรศน์อัจฉริยะรวมถึงการวัดว่าการซื้อมาตรฐานใดที่จะพลาดไป" “เราจับภาพเหตุการณ์ต่างๆ ได้มากขึ้น วัดการหดตัวที่เล็กลง และติดตามแต่ละส่วนได้อย่างละเอียดยิ่งขึ้น”
การตรวจจับการแบ่งตัวของแบคทีเรีย
ต่อไป นักวิจัยใช้ EDA เพื่อศึกษาการแบ่งเซลล์ในแบคทีเรีย ค. พระจันทร์เสี้ยว. วัฏจักรของเซลล์แบคทีเรียเกิดขึ้นในช่วงเวลาหลายสิบนาที ทำให้เกิดความท้าทายที่ชัดเจนสำหรับกล้องจุลทรรศน์เซลล์ที่มีชีวิต พวกเขารวบรวมข้อมูลด้วยความเร็วการถ่ายภาพช้า 6.7 เฟรม/ชม. ความเร็วในการถ่ายภาพที่รวดเร็ว 20 เฟรม/ชม. หรือความเร็วตัวแปรที่เปลี่ยนโดย EDA
ทีมงานพบว่าเครือข่ายการตรวจจับเหตุการณ์ที่พัฒนาขึ้นสำหรับการหดตัวของไมโตคอนเดรียสามารถรับรู้ขั้นตอนสุดท้ายของการแบ่งตัวของแบคทีเรียโดยไม่ต้องมีการฝึกอบรมเพิ่มเติม อาจเนื่องมาจากความคล้ายคลึงกันในรูปร่างของการหดตัวและการมีเครื่องหมายโมเลกุลที่มีลักษณะคล้ายกัน
เทคนิคการใช้กล้องจุลทรรศน์ที่ได้รับการปรับปรุงจะทำให้เซลล์ที่มีชีวิตมีความไวเพิ่มขึ้นเจ็ดเท่า
อีกครั้ง EDA ลดการฟอกสีด้วยแสงเมื่อเปรียบเทียบกับการถ่ายภาพที่รวดเร็วคงที่ และวัดการหดตัวด้วยเส้นผ่านศูนย์กลางเฉลี่ยที่เล็กกว่าการถ่ายภาพช้าอย่างต่อเนื่อง EDA ช่วยให้สามารถถ่ายภาพวงจรของเซลล์ทั้งหมดได้และให้รายละเอียดของการแบ่งเซลล์แบคทีเรียที่ยากต่อการจับภาพโดยใช้ความเร็วการถ่ายภาพคงที่.
แมนลีย์เล่า โลกฟิสิกส์ ทีมงานยังวางแผนที่จะฝึกโครงข่ายประสาทเทียมเพื่อตรวจจับเหตุการณ์ประเภทต่างๆ และใช้สิ่งเหล่านี้เพื่อกระตุ้นการตอบสนองของฮาร์ดแวร์ที่แตกต่างกัน "ตัวอย่างเช่น เราจินตนาการถึงการควบคุมการก่อกวนทางสายตาเพื่อปรับเปลี่ยนการถอดรหัสในช่วงเวลาสำคัญในการสร้างความแตกต่างของเซลล์" เธออธิบาย “เรายังคิดถึงการใช้การตรวจจับเหตุการณ์เป็นวิธีการบีบอัดข้อมูล โดยเลือกพื้นที่จัดเก็บหรือวิเคราะห์ข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับการศึกษาวิจัยนั้นๆ มากที่สุด”
- เพื่อให้นักวิจัยสามารถนำ EDA ไปใช้กับกล้องจุลทรรศน์ได้หลากหลาย ทีมงานจึงจัดทำกรอบการควบคุมเป็น ปลั๊กอินโอเพ่นซอร์ส สำหรับซอฟต์แวร์ Micro-Manager
