Canlı hücrelerin floresan mikroskobu, biyolojik sistemlerin dinamiklerini incelemek için vazgeçilmez bir araç sağlar. Ancak bakteriyel hücre bölünmesi ve mitokondriyal bölünme gibi birçok biyolojik süreç ara sıra meydana gelir ve bu durum onları yakalamayı zorlaştırır.
Bir numunenin sürekli olarak yüksek kare hızında görüntülenmesi, bu tür bölünmeler meydana geldiğinde bunların mutlaka kaydedilmesini sağlayacaktır. Ancak aşırı floresans görüntüleme, ışıkla ağartmaya neden olur ve canlı örnekleri zamanından önce yok edebilir. Bu arada daha yavaş bir kare hızı, ilgi çekici olayların kaçırılması riskini taşır. İhtiyaç duyulan şey, bir olayın ne zaman gerçekleşeceğini tahmin etmenin ve ardından mikroskoba yüksek hızlı görüntülemeye başlaması talimatını vermenin bir yoludur.
İsviçre Federal Teknoloji Enstitüsü Lozan'daki araştırmacılar (EPFL) tam da böyle bir sistem yarattı. Ekip, numune üzerindeki stresi sınırlandırırken biyolojik olayları ayrıntılı olarak görüntülemek için mikroskop kontrolünü otomatikleştiren olay odaklı bir satın alma (EDA) çerçevesi geliştirdi. EDA, ilgilenilen olayların incelikli öncülerini tespit etmek için sinir ağlarını kullanarak görüntüleme hızı veya ölçüm süresi gibi edinim parametrelerini yanıt olarak uyarlar.
“Akıllı bir mikroskop bir nevi sürücüsüz arabaya benzer. Belirli bilgi türlerini, ince kalıpları işlemesi gerekiyor ve daha sonra davranışını değiştirerek yanıt veriyor," diye açıklıyor baş araştırmacı Suliana Manley bir basın açıklamasında. "Bir sinir ağı kullanarak, çok daha incelikli olayları tespit edebiliyoruz ve bunları, edinme hızındaki değişiklikleri yönlendirmek için kullanabiliyoruz."
EDA çerçevesi, şu şekilde açıklanmaktadır: Doğa yöntemleri, canlı görüntü akışı ile mikroskop kontrolleri arasındaki bir geri bildirim döngüsünden oluşur. Araştırmacılar, mikroskoptan görüntü yakalamak için Micro-Manager yazılımını ve bunları analiz etmek için etiketli veriler üzerinde eğitilmiş bir sinir ağını kullandılar. Her görüntü için ağ çıkışı, yavaş ve hızlı görüntüleme arasında geçiş yapmaya yönelik bir karar verme parametresi görevi görür.
Olay tanıma
Yeni tekniklerini göstermek için Manley ve meslektaşları, EDA'yı anlık yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobuna entegre ettiler ve onu, mitokondriyal ve bakteri bölümlerinin süper çözünürlüklü hızlandırılmış filmlerini yakalamak için kullandılar.
Mitokondriyal bölünme tahmin edilemez; genellikle birkaç dakikada bir gerçekleşir ve onlarca saniye sürer. Bölünmenin başlangıcını tahmin etmek için ekip, sinir ağını, kendiliğinden bölünmeler için gerekli olan DRP1 adı verilen bir proteinin varlığıyla birlikte bölünmeye yol açan mitokondriyal şekil değişikliği olan daralmaları tespit edecek şekilde eğitti.
Sinir ağı, görüntü içinde bölünmenin meydana gelme olasılığının daha yüksek olduğu yerleri gösteren daha yüksek değerlere sahip (hem daralmalar hem de DRP1 seviyeleri yüksek olduğunda) "olay puanlarının" bir ısı haritasını çıkarır. Olay puanı bir eşik değerini aştığında, bölme olaylarını ayrıntılı olarak yakalamak için görüntüleme hızı artar. Skor ikinci eşiğe düştüğünde mikroskop, numunenin aşırı ışığa maruz kalmasını önlemek için düşük hızlı görüntülemeye geçer.
Araştırmacılar, mitokondri hedefli floresan etiketleri ifade eden hücreler üzerinde EDA gerçekleştirdi. Her EDA ölçümü sırasında ağ, bakteri bölünmesinin öncüllerini ortalama dokuz kez tanıdı. Bu, ortalama 0.2 saniye boyunca görüntüleme hızını yavaştan (3.8 kare/sn) hızlıya (10 kare/sn) değiştirdi ve karelerin %18'inde hızlı görüntüleme elde edildi. Pek çok sitenin DRP1 biriktirdiğini ancak bölünmeye yol açmadığını belirtiyorlar. Bu siteler ağı tetiklemedi ve bu da onun ilgilenilen olayları ayırt etme yeteneğini gösterdi.
Karşılaştırma amacıyla ekip ayrıca sabit yavaş ve hızlı hızlarda görüntüler topladı. EDA, sabit hızlı hızlı görüntülemeye göre daha az örnekte ışıkla ağartmaya neden oldu, bu da her bir örneğin daha uzun süre gözlemlenmesine olanak sağladı ve nadir mitokondriyal bölünme olaylarını yakalama olasılığını artırdı. Bazı durumlarda, numune, yavaş görüntüleme aşamaları sırasında ışıkla ağartma işleminden kurtularak daha yüksek bir kümülatif ışık dozuna olanak sağladı.
EDA ile ağartma, sürekli yavaş görüntülemeye göre daha yüksek olmasına rağmen, birçok EDA seansı numune sağlığında bozulma olmadan 10 dakikaya ulaştı. Araştırmacılar ayrıca, hızlı görüntü patlamalarıyla yakalandığı gibi, EDA'nın bölünmeden önceki daralmaları ve fisyona yol açan zar durumlarının ilerlemesini daha iyi çözdüğünü buldu.
Manley, "Akıllı mikroskopinin potansiyeli, standart edinimlerin kaçıracağı şeyleri ölçmeyi içerir" diye açıklıyor. "Daha fazla olay yakalıyor, daha küçük kısıtlamaları ölçüyor ve her bir bölümü daha ayrıntılı olarak takip edebiliyoruz."
Bakteriyel bölünmenin tespiti
Daha sonra araştırmacılar bakterilerdeki hücre bölünmesini incelemek için EDA'yı kullandılar. C. crescentus. Bakteriyel hücre döngüsü onlarca dakikalık bir zaman ölçeğinde gerçekleşir ve canlı hücre mikroskobu için belirgin zorluklar yaratır. Verileri 6.7 kare/saatlik yavaş bir görüntüleme hızında, 20 kare/saatlik hızlı bir görüntüleme hızında veya EDA tarafından değiştirilen değişken bir hızda topladılar.
Ekip, mitokondriyal daralmalar için geliştirilen olay tespit ağının, muhtemelen daralma şeklindeki benzerlikler ve işlevsel olarak benzer bir moleküler işaretleyicinin varlığı nedeniyle, ek eğitim gerektirmeden bakteri bölünmesinin son aşamalarını tanıyabildiğini buldu.
Geliştirilmiş mikroskopi tekniği canlı hücreleri yedi kat daha fazla hassasiyetle görür
Yine EDA, sürekli hızlı görüntülemeyle karşılaştırıldığında ışıkla ağartmayı azalttı ve daralmaları, sürekli yavaş görüntülemeye göre önemli ölçüde daha küçük ortalama çaplarla ölçtü. EDA, tüm hücre döngüsünün görüntülenmesini sağladı ve sabit bir görüntüleme hızı kullanılarak yakalanması zor olan bakteriyel hücre bölünmesinin ayrıntılarını sağladı.
Manley anlatıyor Fizik dünyası Ekibin ayrıca farklı türdeki olayları tespit etmek ve bunları farklı donanım yanıtlarını tetiklemek için kullanmak üzere sinir ağlarını eğitmeyi planladığı belirtiliyor. "Örneğin, hücre farklılaşmasındaki önemli anlarda transkripsiyonu modüle etmek için optogenetik bozulmalardan yararlanmayı öngörüyoruz" diye açıklıyor. "Ayrıca, veri sıkıştırma aracı olarak olay tespitini kullanmayı, belirli bir çalışmayla en alakalı veri parçalarını depolama veya analiz için seçmeyi de düşünüyoruz."
- Ekip, araştırmacıların EDA'yı çok çeşitli mikroskoplara uygulayabilmesini sağlamak için kontrol çerçevesini sağlıyor. açık kaynaklı eklenti Mikro Yönetici yazılımı için.
