Цього разу рік тому, Стів Горват шукав ДНК панголіна. Стародавній лускатий мурахоїд став першим у його колекції, яка тоді налічувала близько 200 ссавців. «У мене не було нічого з цього замовлення, тому я відчайдушно хотів їх», - згадував він.
З літа 2017 року Горват, який донедавна був в дослідник боротьби зі старінням в Університеті Каліфорнії в Лос-Анджелесі витрачав до 10 годин на день, пишучи електронні листи до зоопарків, музеїв, акваріумів і лабораторій. Він відвідав бесіди про кажанів і тасманійських дияволів, щоб познайомитися з їхніми утримувачами. Він дістався до далеких куточків світу, випрошуючи ДНК літаючих лисиць, верветових мавп, міні-свиней і гренландських китів.
Маючи цей величезний звіринець зразків, він створив обчислювальні годинники, які можуть обчислювати вік таких різноманітних істот, як землерийки, коали, зебри, свині та «кожного кита, якого ви можете назвати», сказав він, просто дивлячись на їхню ДНК. Але це були лише кроки до завершення амбітного проекту Хорвата: універсального годинника, який міг би вимірювати біологічний вік будь-якого ссавця.
Виміряти вік може здатися не складнішим, ніж за допомогою найближчого годинника чи календаря. Але хронологічний вік є недосконалим показником, оскільки деякі особи та тканини виявляють вплив віку швидше, ніж інші. Десятиліттями вчені шукали об’єктивний і універсальний спосіб вимірювання біологічного старіння, змін у здорових функціях з часом. «Ви хочете мати біомаркер, який точно вимірює вік у багатьох різних тканинах і типах клітин», — сказав Горват, який цього року покинув Каліфорнійський університет у Лос-Анджелесі, щоб стати головним дослідником у Altos Labs, біотехнологічному стартапі, який працює над омолодженням клітин.
Раніше цього року Горват і його колеги завершили створення версії годинника, створеного для ссавців. Тепер він та інші дослідники сподіваються визначити молекулярні процеси, загальні для різних істот, які роблять можливим такий годинник. Горват вважає, що розуміння того, чому такі годинники працюють, може допомогти нам знайти те, що він називає «справжньою першопричиною старіння».
Його годинник заснований на аналізі хімічних міток, званих метильними групами, які висять на ДНК, як обереги на браслеті, і допомагають контролювати активність генів. Вони є продуктами епігенетики (буквально «вище генетики»), галузі, яка вивчає спадкову інформацію, не записану в генетичному коді. Десять років тому Горват і його колеги почали застосовувати свої ноу-хау для створення годинників, спочатку для визначення віку ДНК зі слини, а пізніше для визначення віку крові, печінки та інших окремих тканин.
Багато біологів спочатку були налаштовані скептично, оскільки годинники базувалися на статистиці, а не на розумінні біомолекулярних механізмів. Проте точність годинників витримала випробування та сколихнула біомедичну спільноту. Вчені почали використовувати годинник Горвата у своїх дослідженнях для вимірювання старіння клітин, оскільки годинник був кращим арбітром стану організму та ризику захворювання, ніж хронологічний вік. «Епігенетичні годинники ближчі до реального процесу старіння, ніж будь-які інші біомаркери», — сказав Вадим Гладишев, біохімік з Жіночої лікарні Бригама та Гарвардської медичної школи, який вивчає рак і старіння. Зараз годинник змушує деяких вчених переглянути свої уявлення про те, що таке старіння, а також про його зв’язок із хворобами.
«Тепер у мене є співробітники, які багато працюють над раком молочної залози, і [починають] думати про те, «Якщо у вас прогресивне біологічне старіння, чи це також інформативно для раку молочної залози?»» сказав Сара Хегг, молекулярний епідеміолог Каролінського інституту в Стокгольмі, Швеція. Вона додала, що якщо годинники можуть корисно просвітити, як зупинити процес старіння, що не викликає вікових розладів, «ми можемо запобігти не лише одній хворобі, а багатьом».
Бачити сигнал
Протягом останніх десятиліть дослідники-біологи знову і знову вважали, що годинник для старіння цілком досяжний. Наприклад, на початку 1960-х вони дізналися, що клітини, які ростуть у культурі, не є безсмертними, а гинуть лише після 40-60 раундів реплікації, що свідчить про те, що клітини мають свого роду годинник старіння. У 1982 році дослідники подумали, що, можливо, знайшли механізм годинника, коли виділили теломери, ДНК-білкові комплекси на кінцях хромосом, які скорочуються кожного разу, коли клітина ділиться; коли теломери стають критично короткими, клітини гинуть.
Але теломери не виглядали як годинник старіння. Кореляція довжини теломер з віком і смертністю слабка у людей і відсутня у деяких інших видів. «Теломер [довжина] насправді не відстежує вік. Він просто відстежує проліферацію клітин», — сказав Кен Радж, головний дослідник Altos Labs.
Як альтернатива довжині теломер, у 2009 році Горват почав працювати над годинником на основі транскриптів РНК активних генів клітини, шаблонів для білків, які визначають клітину та дозволяють їй функціонувати. Протягом наступних двох років він намагався змусити цей підхід працювати, але марно: дані транскрипції були просто занадто шумними.
Але в 2010 році Хорват відповів на прохання про допомогу від колеги з UCLA. Щоб вивчити можливі зв’язки між сексуальною орієнтацією та епігенетикою, дослідник збирав слину в однояйцевих близнюків, які відрізнялися сексуальною орієнтацією, з гіпотезою, що ДНК у їхніх клітинах слини може виявити деякі послідовні відмінності в моделях метилювання. Брат-близнюк Горвата — гей; Хорват гетеросексуальний. Вони постачали свої плювки.
Під час аналізу дослідження розглядалися ділянки в ДНК, де розташовані основи цитозину, і перевірялося, які з них були метильовані. (Цитозини є єдиними основами, до яких приєднуються метильні групи.) Нещодавно представлена технологія лабораторії на чіпі дозволила легко перевірити десятки тисяч сайтів цитозину в ДНК кожної клітини. Коли колезі потрібен був статист для аналізу даних, Хорват зголосився запропонувати свої послуги.
Він не знайшов того, що вони шукали. «Не було жодного сигналу про гомосексуалізм», — сказав Горват. «Але оскільки дані були на моєму комп’ютері, я сказав, дозвольте мені поглянути на вплив старіння», оскільки вік близнюків у дослідженні охоплював десятиліття.
До того часу Горват у своїх дослідженнях уникав епігенетичних даних. Зв'язок між моделями метилювання та експресією генів є заплутаним і опосередкованим, і здавалося, що він навряд чи продемонструє корисний зв'язок зі старінням. Але тепер, коли він мав у своєму розпорядженні цей надприбуток епігенетичних даних, здавалося, що шукати нічого страшного.
Горват почав порівнювати моделі метилювання з віком близнюків. У будь-якому окремому зразку слини — або будь-якому зразку з будь-якої тканини — не всі клітини демонструватимуть однакову схему метилювання. Але частку клітин, метильованих за даним цитозином у ДНК, можна виміряти. В одному зразку, наприклад, 40% клітин можуть бути метильовані в певному положенні; в іншому ця частка може становити 45% або 60%.
На свій подив, Горват виявив сильну кореляцію між віком і часткою клітин з метилюванням, навіть коли він подивився лише на одну ділянку в ДНК. Перегляд більшої кількості місць підвищив точність.
«Це все змінило для мене», — сказав він. «Як тільки я подивився на сигнал старіння, він мене вразив».
Горват побудував модель, яка передбачив вік людини від статусу метилювання приблизно 300 цитозинів у мільйонах клітин у зразку слини. «Ви плюєте в чашку, і ми можемо виміряти ваш вік», — сказав він.
Невдовзі він створив епігенетичні моделі годинника для оцінки біологічного віку крові, печінки, мозку та різних інших тканин. Спочатку він виміряв пропорції клітин у кожному зразку, які показали метилювання в певних місцях. З цих даних він створив профілі тканин, які описували пропорції клітин, метильованих у кожному місці.
Щоб побудувати годинник, він передав у комп’ютер тисячі епігенетичних профілів разом із віком кожної тканини. Завдяки машинному навчанню комп’ютер пов’язав вік із моделями метилювання. Це також звузило кількість сайтів, необхідних для прогнозування віку. Потім комп’ютер зважив значення метилювання кожної ділянки у своїх розрахунках, щоб створити найкращу прогностичну формулу для віку, яку Хорват перевірив на окремому наборі зразків відомого віку.
Протягом двох років він об’єднав їхні окремі годинники старіння тканин в одну формулу годинник «пан-тиссус»., опублікованому в 2013 році. Говорять, що годинник пан-тканини «змінив гру». Данило Бельський, епідеміолог Колумбійської школи громадської охорони здоров’я Мейлмана. Формула застосовується до будь-яких людських клітин, що містять ДНК. І будь-хто міг ним скористатися — Горват розмістив програмне забезпечення в Інтернеті. Завантаживши власні дані про метилювання, біологи могли дізнатися, скільки часу зайняло клітини в їхніх зразках.
Кількісне зниження
Тканевий годинник Горвата був на диво точний у передбаченні хронологічного віку. Здається, це також відображало важливі основні відмінності між хронологічним і біологічним віком. Дослідники виявили, що коли за епігенетичним годинником чийсь вік був більшим за хронологічний, ця людина стикалася з вищим ризиком захворювання та смерті. Коли годинник оцінив, що хтось молодший, їхній ризик знизився. Незважаючи на те, що епігенетичний годинник було отримано з даних про хронологічний вік, його алгоритм передбачав смертність краще, ніж вік.
Тож наприкінці 2014 року Горват вирішив чітко відстежувати біологічний вік. Він і його колеги в тому числі Морган Левін (дослідник патології в Єльському університеті, який нещодавно приєднався до Altos Labs) і Луїджі Ферруччі Національного інституту старіння навчив алгоритм на складному показнику, який включав хронологічний вік, а також результати дев’яти хімічних тестів крові, які передвіщали захворювання та смертність. Дані були отримані з крові понад 9,900 дорослих під час Національного дослідження здоров’я та харчування. Отриманий годинник, DNAm PhenoAge, опублікований у 2018 році, передбачив загальну смертність і ризик серцево-судинних захворювань, захворювань легенів, раку та діабету, серед інших результатів. Через рік Горват і команда під керівництвом Аке Т. Лу з Каліфорнійського університету в Лос-Анджелесі випустили ще більш точний прогноз часу до смерті, Похмурий вік, який розглядав стать людини, хронологічний вік, історію куріння та маркери смертності білка крові.
Новий інструмент від Бельського та його колег, представлений у 2020 році та оновлений на початку цього року, діє як старіючий спідометр. При створенні їх Темп старіння біомаркера, вони кількісно визначили швидкість зміни 19 маркерів функції органів у чотири вікові періоди, зібрали їх у єдиний індекс і змоделювали його за допомогою метилювання. «Ми фактично кількісно оцінюємо поточний процес старіння та цілісності системи», — сказав Бельскі. Ті, хто старіє швидше за цим показником, помирають молодшими, сказав він, додавши, що він прогнозує смертність приблизно так само добре, як GrimAge, і може ще краще прогнозувати інсульт і деменцію.
Вікове питання
У 2017 році до Горвата звернулися представники сімейного фонду Пола Г. Аллена після однієї з його доповідей. Їм сподобалася його робота, і вони запропонували йому мріяти про масштаби, адже фонд підтримує починання з високим ризиком. Знайдіть проект, який би ніхто інший не фінансував, сказали вони.
Хорвату не знадобилося багато часу, щоб запропонувати старіючий годинник, який застосовуватиметься до всіх хребетних. Пропозицію прийняли — вона була досить дивною, — але коли Горват усвідомив масштаби того, що вона передбачає, план перетворився на відносно стриманий годинник для всіх ссавців.
До січня 2021 року Горват мав дані про метилювання 128 видів ссавців, і він поставив свій годинник на сервері препринтів biorxiv.org. «Та сама математична формула, ті самі цитозини для миші, щура, собаки чи свині. Ми можемо виміряти старіння в усіх цих видів», — сказав Хорват. Тим не менш, він обійшов світ у пошуках більшого.
Наприкінці літа минулого року Горват спілкувався з Дарреном Пітерсеном, експертом з панголінів Фонд Тіккі Хайвуд в Хараре, Зімбабве, пропонуючи йому матеріали для збору даних про панголінів та кількох інших видів. Ніхто навіть не знав напевно, скільки живуть панголіни. Деякі офіційні дані свідчать про 15-20 років, але Пітерсен вважає, що принаймні деякі види живуть довше. «Одній тварині, яку ми нещодавно зістарили, було близько 34 років (хоча з досить великою похибкою)», — написав він.
З наданих даних про тканини Горват побудував годинник панголіна, ще один таймер тривалості життя, щоб додати до своєї колекції. «Ви хочете свинячий годинник, у мене є свинячий годинник. У мене є годинник для кенгуру і для слонів», – сказав Хорват. Кожен специфічний для виду годинник був благом для вчених у цій галузі. Дослідники слонів, наприклад, хотіли мати годинник для слонів, щоб вони могли визначити вікову структуру диких популяцій, щоб допомогти зусиллям щодо збереження.
Але годинник, який об’єднує їх усі, може допомогти відповісти на більш основне запитання: що таке старіння? Одна з точок зору полягає в тому, що ваше тіло старіє, як ваше взуття, поступово вицвітаючи та розвалюючись від зносу. Але успішні прогнози загального годинника ссавців означають, що щось також спричиняє збій клітин за певним графіком, можливо, через гени розвитку, які не вимикаються, коли свою роботу виконано. «Це свідчить про певний елемент детермінізму в старінні», — сказав Радж, один із понад 100 будівельників годинника.
Дані годинника метилювання свідчать про те, що старіння починається дуже рано, задовго до того, як організм руйнується. В Папір 2021, Гладишев та його колеги описують годинник метилювання, який визначає дату етапів розвитку ссавців. Вони виявили, що під час раннього ембріогенезу у мишей своєрідне омолодження зводить вік ембріона до нуля. Біологічне старіння тоді йде швидкими темпами, навіть незважаючи на те, що людські діти, ймовірно, стають сильнішими, а не слабшають протягом цього часу, і смертність людей знижується приблизно до 9 років. «Для мене це дуже важливо, тому що це зводить питання старіння до процесу, який невід’ємний від процесу розвитку», — сказав Радж.
Два недавніх дослідження голого землекопа, гризуна з неймовірно довгою 37-річною тривалістю життя, показують, що тварина старіє епігенетично, навіть якщо її шанси померти не зростають із хронологічним віком. «Я думаю, що рівень смертності — не найкращий показник старіння», — сказав Гладишев, який очолював дослідження одне з досліджень. «Старіння є неминучим наслідком життя».
Старіння все ще відображає вплив досвіду, поведінки та навколишнього середовища, звичайно. Куріння та перебування на сонці, наприклад, можуть прискорити його, як вимірюють метилювання та інші маркери, а фізичні вправи або низькокалорійна дієта можуть зупинити його. У роботі, опублікованій минулого березня, епігенетичний годинник пристосований до бабаків показали, що сплячка уповільнює старіння, і папір опубліковані минулого тижня, показали, що те саме стосується кажанів. Годинник зроблено для макак-резусів припускає, що в 2017 році ураган Марія прискорив старіння в колонії мавп на острові біля узбережжя Пуерто-Ріко.
Первородний гріх
Ніхто до кінця не знає, чому годинники працюють. Деякі, але не всі задіяні гени та молекулярні шляхи були ідентифіковані, і дослідники все ще вивчають, як моделі метилювання впливають на поведінку та здоров’я клітин, тканин і органів. «Це повертається до того, що я називаю «первородним гріхом будівництва», – сказав Горват. «Вона заснована на [статистичній] регресійній моделі, яка на певному рівні агностична щодо біології».
Щоб спокутувати цей гріх, Радж і Хорват почали шукати біологічні кореляти для епігенетичного старіння. Збурення біохімічних шляхів, які організм використовує, щоб відчути свою потребу в поживних речовинах, уповільнюють старіння, вони нещодавно виявили відповідно до впливу дієт з обмеженням калорій на старіння. Порушення роботи мітохондрій прискорює її. Годинник також відстежує дозрівання стовбурових клітин. Якщо ці процеси пов’язані на більш глибокому рівні, епігенетичні годинники можуть виявити об’єднуючі механізми старіння, написали автори в 2022 році. папір в Старіння природи.
Однак, якими можуть бути ці об’єднуючі механізми або чому статус метилювання так добре відстежує старіння, ще належить повністю визначити. «Ми насправді не знаємо, чи епігенетичні годинники причинно пов’язані зі старінням», — сказав Хегг.
Навіть якщо це так, епігенетичні годинники майже напевно вимірюють лише частину того, що відбувається під час старіння, сказав Метт Кеберлайн, дослідник Школи медицини Вашингтонського університету в Сіетлі, який вивчає біологію старіння. «Чи насправді вони вимірюють більше, ніж один вимір біологічного віку, не ясно», — сказав він. «Це частина проблеми тут — злиття епігенетичного віку з біологічним. На мій погляд, це не еквівалент».
Радж припускає, що зміни метилювання відображають втрату клітинної ідентичності з віком. Усі клітини в організмі мають однакову ДНК, тому те, що робить клітину печінки клітиною печінки, а клітину серця клітиною серця, — це модель експресії генів, яку контролює епігенетика. Оскільки зміни в метилюванні накопичуються з віком, деякі з цих елементів контролю можуть бути втрачені, замінені програмами розвитку, які знову з’являються, і які слід вимкнути, вважає Радж.
Хоча годинник метилювання може бути найточнішим монітором біологічного віку на даний момент, деякі дослідження підказують є місце для вдосконалення. Більш точний предиктор міг би поєднати кількісно визначені клітинні властивості — скажімо, рівень експресії білка, метаболіту або гена — з фізіологічними сигналами та індексом слабкості. «Тепер ми можемо виміряти стільки речей в людській істоті», — сказав Хегг. «Чим більше цих речей ви визначите кількісно, тим точніше ви охопите своє старіння».
Годинники метилювання також мають обмежене клінічне застосування, попереджає Хегг. Люди можуть придбати зчитування свого біологічного віку з різних комерційних джерел, але результати не тільки часто суперечливі, вони не мають клінічної значущості, оскільки годинники призначені для аналізу на груповому рівні в дослідженнях. «Вони не створені для прогнозування на індивідуальному рівні», — сказала вона.
І навіть якщо хтось змінить свій спосіб життя таким чином, що знизить свій біологічний вік, виміряний цими годинниками, чи матиме він довше життя чи менший ризик захворювання? «Ми ще цього не знаємо», — сказав Кеберляйн.
Горват зараз готує статтю про свій годинник, який є ссавцями, для публікації в журналі. Хоча він, здавалося б, досяг своєї мети, прогалини в його колекції все ще турбують його. У травні він листувався зі старшими кураторами музею в Австралії щодо отримання тканин сумчастих кротів, маленької, майже сліпої істоти, яка проводить більшу частину свого часу під землею. «Ми вже зібрали дані про 348 видів ссавців, але ми хотіли б додати більше», — сказав він.
Коли Горват запропонував цей проект, він мав намір проаналізувати 30 видів, але 30 незабаром перетворилися на 50, потім на 100, а потім у три рази більше. «Мені потрібно рухатися, — сказав він, — тому що в мене є бажання збирати більше».
