Kính hiển vi huỳnh quang của các tế bào sống cung cấp một công cụ không thể thiếu để nghiên cứu động lực học của các hệ thống sinh học. Tuy nhiên, nhiều quá trình sinh học – chẳng hạn như phân chia tế bào vi khuẩn và phân chia ty thể – xảy ra không thường xuyên, khiến chúng khó nắm bắt.
Việc liên tục chụp ảnh một mẫu ở tốc độ khung hình cao sẽ đảm bảo rằng khi sự phân chia như vậy xảy ra, chúng chắc chắn sẽ được ghi lại. Nhưng hình ảnh huỳnh quang quá mức gây ra hiện tượng tẩy trắng bằng ánh sáng và có thể phá hủy sớm các mẫu sống. Trong khi đó, tốc độ khung hình chậm hơn có nguy cơ bỏ lỡ các sự kiện đáng quan tâm. Điều cần thiết là một cách để dự đoán khi nào một sự kiện sắp xảy ra và sau đó hướng dẫn kính hiển vi bắt đầu chụp ảnh tốc độ cao.
Các nhà nghiên cứu tại Viện Công nghệ Liên bang Thụy Sĩ Lausanne (EPFL) đã tạo ra một hệ thống như vậy. Nhóm đã phát triển một khung thu nhận theo hướng sự kiện (EDA) giúp tự động hóa việc điều khiển kính hiển vi để ghi lại chi tiết các sự kiện sinh học đồng thời hạn chế áp lực lên mẫu. Sử dụng mạng thần kinh để phát hiện các dấu hiệu báo trước tinh tế của các sự kiện đáng quan tâm, EDA điều chỉnh các tham số thu nhận – chẳng hạn như tốc độ hình ảnh hoặc thời lượng đo – để đáp ứng.
“Kính hiển vi thông minh giống như một chiếc ô tô tự lái. Nó cần xử lý một số loại thông tin nhất định, các mẫu tinh vi mà sau đó nó phản ứng lại bằng cách thay đổi hành vi của mình,” điều tra viên chính giải thích Suliana Manley trong một thông cáo báo chí. “Bằng cách sử dụng mạng thần kinh, chúng tôi có thể phát hiện các sự kiện tinh vi hơn nhiều và sử dụng chúng để thúc đẩy các thay đổi về tốc độ thu nhận.”
Khung EDA, được mô tả trong Phương pháp tự nhiên, bao gồm một vòng phản hồi giữa luồng hình ảnh trực tiếp và bộ điều khiển kính hiển vi. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng phần mềm Micro-Manager để chụp ảnh từ kính hiển vi và mạng lưới thần kinh được đào tạo về dữ liệu được dán nhãn để phân tích chúng. Đối với mỗi hình ảnh, đầu ra mạng đóng vai trò là tham số ra quyết định để chuyển đổi giữa hình ảnh chậm và hình ảnh nhanh.
công nhận sự kiện
Để chứng minh kỹ thuật mới của họ, Manley và các đồng nghiệp đã tích hợp EDA vào một kính hiển vi chiếu sáng có cấu trúc tức thời và sử dụng nó để ghi lại các bộ phim tua nhanh thời gian siêu phân giải về sự phân chia của ty thể và vi khuẩn.
Sự phân chia ty thể là không thể đoán trước, thường xảy ra vài phút một lần và kéo dài hàng chục giây. Để dự đoán sự khởi đầu của quá trình phân chia, nhóm nghiên cứu đã huấn luyện mạng lưới thần kinh để phát hiện sự co thắt, một sự thay đổi về hình dạng ty thể dẫn đến sự phân chia, kết hợp với sự hiện diện của một loại protein gọi là DRP1 cần thiết cho quá trình phân chia tự phát.
Mạng nơ-ron tạo ra một bản đồ nhiệt gồm “điểm số sự kiện”, với các giá trị cao hơn (khi cả mức co thắt và mức DRP1 đều cao) cho biết các vị trí trong hình ảnh có nhiều khả năng xảy ra sự phân chia. Khi điểm sự kiện vượt quá giá trị ngưỡng, tốc độ hình ảnh sẽ tăng lên để nắm bắt chi tiết các sự kiện phân chia. Khi điểm số giảm xuống ngưỡng thứ hai, kính hiển vi sẽ chuyển sang hình ảnh tốc độ thấp để tránh để mẫu tiếp xúc với ánh sáng quá mức.
Các nhà nghiên cứu đã thực hiện EDA trên các tế bào thể hiện nhãn huỳnh quang nhắm mục tiêu ty thể. Trong mỗi phép đo EDA, trung bình 0.2 lần mạng đã nhận ra tiền thân của quá trình phân chia vi khuẩn. Thao tác này đã chuyển đổi tốc độ chụp ảnh từ chậm (3.8 khung hình/giây) sang nhanh (10 khung hình/giây) trong thời gian trung bình là 18 giây, dẫn đến khả năng tạo ảnh nhanh cho 1% số khung hình. Họ lưu ý rằng nhiều trang web tích lũy DRPXNUMX nhưng không dẫn đến sự phân chia. Các trang web này không kích hoạt mạng, chứng tỏ khả năng phân biệt các sự kiện đáng quan tâm của mạng.
Để so sánh, nhóm nghiên cứu cũng thu thập hình ảnh với tốc độ nhanh chậm không đổi. EDA ít gây ra hiện tượng tẩy trắng mẫu bằng phương pháp quang hóa hơn so với chụp ảnh nhanh tốc độ cố định, cho phép quan sát từng mẫu lâu hơn và tăng khả năng bắt được các sự kiện phân chia ty thể hiếm gặp. Trong một số trường hợp, mẫu được phục hồi sau quá trình tẩy trắng bằng quang hóa trong các giai đoạn chụp ảnh chậm, cho phép liều lượng ánh sáng tích lũy cao hơn.
Mặc dù tẩy trắng với EDA cao hơn so với chụp ảnh chậm liên tục, nhưng nhiều phiên EDA đạt tới 10 phút mà không làm suy giảm sức khỏe mẫu. Các nhà nghiên cứu cũng phát hiện ra rằng EDA giải quyết tốt hơn các co thắt trước khi phân chia, cũng như sự tiến triển của các trạng thái màng dẫn đến phân hạch, như được ghi lại bằng loạt ảnh nhanh.
Manley giải thích: “Tiềm năng của kính hiển vi thông minh bao gồm việc đo lường những hoạt động mua lại tiêu chuẩn sẽ bỏ lỡ. “Chúng tôi ghi lại nhiều sự kiện hơn, đo lường các giới hạn nhỏ hơn và có thể theo dõi từng bộ phận một cách chi tiết hơn.”
Phát hiện phân chia vi khuẩn
Tiếp theo, các nhà nghiên cứu đã sử dụng EDA để nghiên cứu sự phân chia tế bào ở vi khuẩn C. lưỡi liềm. Chu kỳ tế bào vi khuẩn xảy ra trong khoảng thời gian hàng chục phút, tạo ra những thách thức rõ rệt đối với kính hiển vi tế bào sống. Họ đã thu thập dữ liệu ở tốc độ hình ảnh chậm là 6.7 khung hình/giờ, tốc độ hình ảnh nhanh là 20 khung hình/giờ hoặc tốc độ thay đổi do EDA chuyển đổi.
Nhóm nghiên cứu phát hiện ra rằng mạng phát hiện sự kiện được phát triển cho sự co thắt của ty thể có thể nhận ra các giai đoạn cuối cùng của quá trình phân chia vi khuẩn mà không cần đào tạo thêm – có thể là do sự giống nhau về hình dạng co thắt và sự hiện diện của một dấu hiệu phân tử tương tự về mặt chức năng.
Kỹ thuật kính hiển vi cải tiến nhìn thấy các tế bào sống với độ nhạy cao hơn bảy lần
Một lần nữa, EDA giảm quá trình tẩy trắng bằng quang hóa so với hình ảnh nhanh liên tục và đo được các điểm co thắt với đường kính trung bình nhỏ hơn đáng kể so với hình ảnh chậm liên tục. EDA cho phép chụp ảnh toàn bộ chu kỳ tế bào và cung cấp thông tin chi tiết về sự phân chia tế bào vi khuẩn khó chụp bằng tốc độ chụp ảnh cố định.
Manley kể Thế giới vật lý rằng nhóm cũng có kế hoạch đào tạo các mạng thần kinh để phát hiện các loại sự kiện khác nhau và sử dụng chúng để gợi lên các phản ứng phần cứng khác nhau. Cô ấy giải thích: “Ví dụ, chúng tôi hình dung việc khai thác các nhiễu loạn quang di truyền để điều chỉnh quá trình phiên mã vào những thời điểm quan trọng trong quá trình biệt hóa tế bào. “Chúng tôi cũng nghĩ đến việc sử dụng tính năng phát hiện sự kiện như một phương tiện nén dữ liệu, chọn để lưu trữ hoặc phân tích các phần dữ liệu phù hợp nhất với một nghiên cứu nhất định.”
- Để cho phép các nhà nghiên cứu triển khai EDA trên nhiều loại kính hiển vi, nhóm đang cung cấp khung điều khiển dưới dạng plug-in mã nguồn mở cho phần mềm Micro-Manager.
