Missionserklæringen på hjemmesiden for Stanford University laboratory of Sergiu Paşca er på én gang enkel og spektakulært ambitiøs. Hans gruppe "søger at forstå de regler, der styrer de molekylære og cellulære trin, der ligger til grund for samlingen af det menneskelige nervesystem og de molekylære mekanismer, der fører til neurologiske og psykiatriske sygdomme."
Paşcas valgte vej til dette mål bruger en avanceret form for stamcelleteknologi. For det første omprogrammerer han genetisk hudceller fra autister og patienter med lidelser som skizofreni til at blive alsidige stamceller; så får han cellerne til at sætte sig i en mere defineret tilstand som neuralt væv i en laboratorieskål. Ved at observere, hvordan disse celler fungerer eller ikke fungerer, får Paşca, professor i psykiatri og adfærdsvidenskab ved Stanford og direktør ved Wu Tsai Neurosciences Institute, indsigt i, hvad der gør hjernen hos mennesker med neurologiske tilstande anderledes.
I sit skub for at gøre disse modelsystemer mere sande, har han lavet tilsyneladende fantastiske videnskabelige innovationer. I sit Palo Alto-laboratorium har Paşca skabt miniature sfæriske væv eller organoider, der ligner forskellige områder af den menneskelige hjerne. Han og hans kolleger har forbundet organoider af hjerne, rygmarv og muskelvæv til "assembloids", der kan rykke på kommando.
Og i nyt arbejde Paşcas team har netop annonceret i dag, at menneskelige organoider, der indføres i den udviklende hjerne hos en ung rotte, spontant kan sprede sig ud og integrere sig i dyrets neurale kredsløb - et resultat, der viser vejen mod forskningsmodeller af den menneskelige hjerne, der bliver stadig flere naturtro, men alligevel praktisk og etisk at arbejde på.
Da Vilcek Foundation i New York tildelte Paşca deres 2018-pris for kreativt løfte i biomedicinsk videnskab, gjorde de det, fordi hans "indsats førte til et lager af patient-afledte hjernekulturer, der er blandt de mest realistiske modeller af hjerneudvikling, der er tilgængelige for forskere i dag. ."
Ifølge hans postdoktorale rådgiver, Ricardo Dolmetsch, præsidenten for forskning og udvikling hos genterapivirksomheden uniQure: “Sergius arbejde rejser muligheden for, at vi en dag vil være i stand til at transplantere manglende hjerneceller til mennesker med sygdom eller udvikle laboratoriemodeller af neurologiske eller psykiatriske sygdomme, som vi kan bruge til at udvikle medicin."
Vi talte med Paşca sidste sommer via Zoom og telefon. Interviewene er blevet komprimeret og redigeret for klarhedens skyld.
Har du altid ønsket at lave videnskabelig forskning?
Fra en tidlig alder. Ja.
Jeg voksede op i Rumænien, i en lille by i Transsylvanien. Som barn byggede jeg et laboratorium i kælderen i min families hus. Jeg ville prøve at forbedre væksten af planter ved at tilføje forskellige kemikalier til jorden og derefter måle deres effekt. En gang tilføjede jeg et kobberbaseret molekyle. Det fik en af mine planter til at stige med 20%. Det fangede mig på forskning.
Og i dag dyrker man nerveceller i et laboratorium. Hvordan opstod det?
[Griner.] Det er en lang historie. Jeg gik i skole i årene efter vælten af Ceauşescu-diktaturet. På den tid led Rumænien af diktaturets langsigtede virkninger - isolation, underudvikling. I slutningen af gymnasiet vandt jeg en pris i en national konkurrence i kemi. Prisen kom med optagelse på et hvilket som helst rumænsk universitet. Jeg valgte Iuliu Haţieganu University of Medicine i Cluj-Napoca. Tanken var at blive læge-forsker. Jeg troede dengang, og føler stadig, at verden har brug for flere af dem.
Desværre opdagede jeg engang på medicinstudiet, at der var få ressourcer: ingen tilskud, ingen reagenser til laboratoriearbejde. Men jeg havde en meget dedikeret professor, og hun brugte 200 euro af sine egne penge - en formue på det tidspunkt - til at bestille et lille reagenssæt fra Tyskland. Vi planlagde så i et år, hvordan vi bedst kunne bruge det.
Og det var sådan, at studere hjernesygdomme først kom op for mig. Jeg havde overvejet at bruge det reagenssæt til at teste for metabolitter i blodet hos patienter med hjerte-kar-sygdomme. Men for at lære noget, skulle jeg teste hundredvis, måske tusindvis af patienter. Vi havde kun reagenser nok til 50 reaktioner!
En dag, mens jeg var i en statistiktime, slog det mig: Den eneste måde at lave en undersøgelse med en lille gruppe patienter på ville være at se på en sygdom, der var sjælden. Jeg tænkte: autisme.
Autisme? Det er ikke så sjældent - én ud af 50 har en form for det.
Det vidste vi ikke for 20 år siden.
Min idé var at se, om vi kunne finde signaturer på tilstanden i blodet hos børn med autisme. For at udføre undersøgelsen var jeg nødt til at overbevise forældre om at donere små mængder af deres børns blod. Det var hjerteskærende at tale med dem. Det åbnede mine øjne for den enorme lidelse, som familierne gik igennem. Forældrene undrede sig: "Hvad forårsagede dette?"
Det eneste, jeg kunne sige, var: "Intet er kendt."
For at kunne give bedre svar tilmeldte jeg mig et kursus i Bukarest, som blev tilbudt af International Brain Research Organisation, IBRO. De var amerikanske og britiske neurovidenskabsmænd, der forsøgte at bringe avanceret hjernevidenskab til isolerede lande. Klarheden i deres præsentationer og skønheden i de neurovidenskabelige opdagelser, de beskrev, begejstrede mig enormt.
På timerne lærte jeg Jack McMahan at kende, en af grundlæggerne af neurobiologiprogrammet på Stanford. Vi holdt kontakten, og senere hjalp han mig med at komme til Californien.
Hvad blev der af din metabolitundersøgelse?
Vi opdagede, at nogle patienter med autisme havde abnormiteter i deres et-kulstofstofskifte. Denne vej, som er afhængig af folat og B-vitaminer, var let forstyrret, og dette var sandsynligvis relateret til en kombination af genetiske og ernæringsmæssige faktorer.
Da jeg afsluttede lægestudiet, havde jeg udgivet flere artikler om autisme. Jack McMahan læste dem og sagde: "Hvorfor kommer du ikke til Stanford? Jeg har en kollega, der er interesseret i at flytte hans laboratorium i denne retning." Det var Ricardo Dolmetsch, som et par år senere blev global chef for neurovidenskab ved Novartis Institutes for Biomedical Research.
Det tog et stykke tid at få finansiering, men til sidst modtog jeg et IBRO-stipendium og kom til Palo Alto.
Hvad var din opgave i Dolmetsch-laboratoriet?
At skabe en ny tilgang til at lære om den menneskelige hjerne.
Et par år tidligere havde Shinya Yamanaka fra University of California, San Francisco og Kyoto University fundet ud af, hvordan man tager hudceller fra mus og omprogrammerer dem til at blive til inducerede pluripotente stamceller - iPS-celler. Stamceller kan lokkes ind i alle slags forskellige celler, inklusive neuroner, nervesystemets byggesten. Yamanaka ville få Nobelprisen for dette.
I Ricardos laboratorium planlagde jeg at finde måder at transformere menneskelige iPS-celler til neuroner. Idéen var at få hudceller fra børn med autisme, gøre dem tilbage til stamceller og derefter guide dem til at blive neuroner i en petriskål. Hvis det lykkedes, håbede vi at springe over de barrierer, der har forhindret os i fuldt ud at forstå, hvordan det menneskelige nervesystem udvikler sig. Dette ville være en måde at forstå med større klarhed det biologiske grundlag for neuropsykiatriske tilstande som autisme, epilepsi og skizofreni.
Hvad er disse barrierer?
Hovedproblemet er den menneskelige hjernes uudholdelige utilgængelighed.
Når noget går galt i milten eller leveren, tager lægerne en biopsi og analyserer vævet. Denne praksis revolutionerede medicinen. Forskere har været i stand til at tage patienters celler, lægge dem i et fad, identificere de fejlfunktionelle mekanismer og anvende forskellige forbindelser for at genoprette dem. Det er sådan, de har opdaget nye stoffer.
Men undtagen i sjældne situationer borer vi ikke gennem kraniet på en levende person for direkte at studere menneskets hjernevæv. Ud over de medicinske risici er der dybe kulturelle tabuer. Vi har en tendens til at forbinde hjernen med "os", med hvem vi er. Ved at berøre hjernen direkte, opfattes disse metoder på en måde som at forstyrre "selvet".
Når jeg tænker tilbage på mine kliniske rotationer på medicinstudiet, følte jeg mig næsten misundelig på mine kolleger på onkologisk afdeling. Den molekylære biologiske revolution, kombineret med tilgængeligheden af det kræftvæv, de var interesseret i, betød, at de havde nye behandlinger i pipelinen. Der skete fantastiske ting med leukæmi, for eksempel.
Med autisme havde vi intet. Vi kunne ikke identificere de mekanismer, der forårsagede problemerne, fordi vi ikke direkte kunne studere hjernevæv. Og selvom vi kunne, ville vi ikke have vidst, hvad vi skulle kigge efter.
Kunne du ikke studere menneskeligt hjernevæv opnået fra obduktioner?
Post-mortem hjernen fortæller dig lidt om den elektriske aktivitet af levende neuroner. Du skal måle den aktivitet, fordi det er, hvad neuroner i hjernen gør: De affyrer elektriske signaler.
Hvad angår dyremodeller, har de begrænsninger, når det kommer til undersøgelser af psykiatriske lidelser. Den menneskelige hjerne er mere kompliceret end hos mus eller endda makakaber. Millioner af års evolution adskiller os fra disse dyr. Vi har set utallige eksempler på lægemidler, der havde stor succes i gnavere og derefter fejlede i kliniske forsøg med mennesker.
Jeg tænkte, at vi kunne flytte tingene fremad ved selv at lave noget levende menneskelig hjernevæv.
Din idé må have været kontroversiel.
Åh ja. Der var folk, der troede, at det ikke ville virke. De troede, at ved at transformere hudcellerne, ville man miste sygdommen patofysiologien, og så ville vi ikke være i stand til at opdage noget nyt.
Men inden for otte måneder havde vi fungerende menneskelige neuroner fra stamceller, der var startet som huden på patienter med en genetisk form for autisme. Når du kiggede på dem under mikroskopet, kunne du se dem udløse calciumsignaler. Vi var på vej et sted hen.
Hvordan laver man neuroner?
Cellulær omprogrammering fik os stamceller fra hudcellerne. Derefter lokkede vi stamcellerne til at differentiere til andre typer celler.
Stamceller elsker at differentiere sig. De skal blive til andre celletyper. Og de har faktisk en stor sandsynlighed for at blive neuroner næsten som standard. Du behøver ikke gøre så meget for at lave neuroner, selvom det hjælper at vejlede dem. Det, du gør, er, at du spiger mediet, som stamcellerne holdes i, med molekyler, der fremmer transformation. Nogle gange tager man også nogle molekyler væk.
Vi havde snart millioner af smukke neuroner. Den dårlige nyhed var, at vores neuroner satte sig fast i bunden af en petriskål i et enkelt cellelag, hvor de efter uger i dyrkning gav ud. Hvis vi skulle afsløre, hvad der sker med den menneskelige hjerne, når den udvikler sig over måneder efter måneder, havde vi brug for længerevarende neuroner.
Jeg havde en idé. Jeg købte et sæt laboratorieskåle af plastik belagt med et nonstick-stof, og vi dyrkede cellerne i dem. Utroligt nok virkede gambit! Cellerne kunne ikke klæbe til fadet. I stedet flød de rundt i mediet og vedligeholdt dem og samlede sig til små kugler på størrelse med ærter.
Først kaldte vi disse flydende klumper af celler for sfæroider. Senere blev de kendt som organoider - noget, der lignede et specifikt organ, men som ikke var et.
Hvordan var cellerne i disse kugler forskellige fra dine enlige neuroner?
De voksede i tredimensionelt rum. De bevægede sig rundt og interagerede med hinanden. Det er vigtigt, at de kunne opbevares i et fad i længere tid.
Under de rigtige omstændigheder kunne vi holde organoiderne i 900 dage. Og det gav os mulighed for at observere nye ting. For eksempel, efter omkring ni eller 10 måneder, blev cellerne mere som postnatale neuroner end prænatale. De så ud til at have en fornemmelse af tidens gang, og hvad det skulle betyde for deres udvikling.
Hvor nyttige var organoiderne til din forskning?
Lad mig fortælle dig om et eksperiment, vi udførte med dem.
Der er en genetisk sygdom kaldet 22q11.2-deletionssyndrom, der involverer tab af en del af det 22. kromosom. Patienter har en 30-dobling af risikoen for skizofreni. De kan også udvikle autisme eller andre neuropsykiatriske lidelser. Vi rekrutterede 15 patienter og 15 sunde kontroller og begyndte at lave neuroner, der ligner hjernebarken fra den hud, de donerede. Vi så, at neuronerne fra patienterne havde unormale elektriske egenskaber. De kunne ikke kommunikere ordentligt med hinanden.
Nu behandles skizofreni ofte med antipsykotiske lægemidler. Vi puttede nogle af disse stoffer i et fad med kortikale organoider lavet af vores patienters celler, og vi så, at de antipsykotiske stoffer vendte problemet med neuronernes elektriske egenskaber.
Det betød, at vi nu havde en måde at teste disse stoffer i en skål.
Du talte om organoider. Men hvad er assembloids?
Assembloids er et nyt modelsystem, vi fandt på for seks til syv år siden. De er tredimensionelle cellekultursystemer bygget af mindst to forskellige typer organoider, eller ved at kombinere organoider med nogle andre specialiserede celletyper. Ved at sætte dem sammen kan vi se nye celleegenskaber, der opstår fra deres tætte interaktioner.
Du kan sætte to organoider, der ligner forskellige hjerneområder, sammen og se, hvordan neuronerne projicerer til hinanden og derefter forbindes for at danne kredsløb. Eller du kan kombinere organoider med immunceller og se på neuroimmune interaktioner i sygdom.
For eksempel er der en sjælden type autisme forbundet med en genetisk lidelse kaldet Timothy syndrom. Det er forårsaget af en enkeltbogstavsmutation i et gen, der koder for en calciumkanal. Det tillader for meget calcium at trænge ind i cellerne, når de modtager elektriske signaler. Det interfererer med transmissionen af kemiske signaler i neuroner og andre excitable celler.
Vi tog hudceller fra patienter med Timothy syndrom, lavede assembloids og observerede derefter, hvad der skete i dem. Vi kunne se, at neuronerne vokset fra patienternes celler bevægede sig oftere, men de bevægede sig over kortere afstande end neuroner fra den raske kontrolgruppe. Patienternes celler kom i sidste ende bagud i deres organisation.
Det må have været spændende at være vidne til dette i realtid.
Du kunne se det! Du kunne bogstaveligt talt se det med dine egne øjne!
Vi havde dette farvestof, der farvede calcium. I det øjeblik calcium kom ind i cellerne, kunne man se farverne gå op og ned og måle, hvor meget calcium der kom ind i cellen. Der var mere af det i patienternes celler.
Vi har brugt seks år på at finde ud af præcis, hvordan den calciumkanal forårsager defekter i bevægelsen af disse specifikke typer neuroner. Den muterede kanal hos patienter påvirker to forskellige molekylære veje i neuroner. Det er vigtigt, at vi fandt ud af, at du har brug for to forskellige stoffer for at genoprette aktiviteten. Vi tænker, at vi nu har grundlaget for, hvad der i fremtiden kan få os til en behandling.
Vi ville aldrig have været i stand til at lære dette uden assembloiderne, fordi du har brug for, at cellerne interagerer i tre dimensioner for at fange det.
I dit nye papir annoncerer du, at dit laboratorium skabte en rotte, hvor menneskelige neuroner dækker en tredjedel af dyrets cortex i en halvkugle og dybt integreres i hjernen. Hvorfor lave denne model?
I mere end et årti har vi lavet kulturerne i en ret, der rekapitulerer mange aspekter af et menneskes nervesystem. Men der er begrænsninger for disse kulturer: De neuroner, vi har lavet, vokser ikke så store i størrelse. Der er ingen adfærdsmæssige output, som der ville være i en faktisk menneskelig hjerne. Og de modtager ikke sensoriske input, der ville forme deres udvikling - cortex skal modtage signaler. Vi har forsøgt at give noget meningsfuldt eksternt input til disse menneskelige neuroner.
Så det næste skridt var at dyrke menneskelige neuroner inde i hjernen på en rotte. Vi tog organoiderne og transplanterede dem ind i hjernebarken på en rottehvalp. Organoidet blev vaskulariseret af rotten og voksede til sidst til at dække en tredjedel af dens hjernebarkhalvdel.
Jeg troede, du ikke var stor fan af dyremodeller til forskning i menneskelig hjerne. Hvad skete der?
Jeg tror, at dyremodeller og menneskecellemodeller er komplementære. I dette tilfælde giver transplantation til dyr os mulighed for at integrere menneskelige neuroner i kredsløb for at forstå disse sygdomme og teste lægemidler. Det er også en anden måde at forstå, hvordan menneskelige neuroner behandler information i levende kredsløb.
Så disse menneskelige neuroner fra organoiderne har haft en chance for at vokse i rottehjerner, og de har været i stand til at få input og output fra dyret. Hvordan er de sammenlignet med neuroner, der kun er vokset i organoiderne? Og hvordan sammenligner de sig med neuronerne, der vokser i vores egen hjerne?
Transplanterede menneskelige neuroner er omkring seks gange større end menneskelige neuroner af sammenlignelig udvikling, der opretholdes i en skål. De er også mere modne elektrofysiologisk og danner flere synapser og er meget tættere på neuroner i den postnatale menneskelige hjerne.
Ser du nogen former for adfærdsforskelle hos disse rotter, der har erhvervet så mange menneskelige neuroner?
Nej. Der er ingen forskelle i de kognitive og motoriske opgaver, hvor vi testede rotterne. Vi har også bekræftet, og de oplever ikke anfald. Rotterne kan dog trænes til at forbinde stimulering af menneskelige neuroner med levering af en belønning. Dette giver hidtil usete muligheder for at studere menneskelige hjernesygdomme.
På hvilket tidspunkt skal dine assembloids og organoider have en form for juridiske rettigheder?
Jeg tror, at for in vitro-kulturer er de kun klynger af celler. Vi betragter dem ikke som hjerner. Det bliver mere nuanceret, når det kommer til transplantation til dyr.
Hvordan har bioetikere det med dine eksperimenter?
Vi arbejder tæt sammen med dem. Hele vejen langs denne vej har jeg været aktivt involveret i diskussioner med etikere fra Stanford og videre. Alle de eksperimenter, vi laver, bliver nøje overvåget og diskuteret med etikere. Vi laver ikke eksperimenterne isoleret. Eksperimenter diskuteres, før de udføres og bestemt mens de kører. Vi vil tale om implikationerne, fordele og ulemper.
Tænker du nogensinde på Frankenstein historie?
Jeg tænker meget over det. Men jeg tror, at historien ikke er så relevant for nutidens videnskab. I dagens verden kan der udvikles teknologier, der er etiske. Meget har at gøre med forskerens motiv. Mit langsigtede mål er at finde en behandling og måske en kur mod disse neuro-udviklingsforstyrrelser. Det har været min nordstjerne.
For nogle år siden, før hun modtog Nobelprisen for CRISPR, spurgte jeg Jennifer Doudna, om hun var bekymret for det potentielle misbrug af denne genredigeringsteknologi. Hun svarede, at hun var bekymret over "ønsket i nogle områder om at skynde sig frem for at ændre menneskelige embryoner." Ikke længe efter meddelte en ambitiøs forsker i Shenzhen, Kina, at han havde brugt CRISPR til at revidere den genetiske kode for to menneskelige babyer. Bekymrer du dig nogensinde om at samle avisen op og opdage, at en videnskabsmand et eller andet sted har brugt dit arbejde til for tidligt at producere dele af en menneskelig hjerne?
Nej. En af de ting, der adskiller organoidt arbejde fra CRISPR, er de nødvendige ressourcer til eksperimenterne. At lave en genredigering med CRISPR kræver kun noget træning og få ressourcer. Det er muligt at gøre det i dit køkken! Det, vi laver, kræver meget mere tid og penge. At holde celler i live i 900 dage er ret dyrt og kræver specialiseret træning og faciliteter. Alene det faktum giver os et pusterum til at bearbejde vores opdagelser og deres implikationer.
Der er få steder med den nødvendige infrastruktur og ekspertise til at gøre dette. Vi forsøger at replikere menneskelig hjerneudvikling, hvilket tager meget lang tid. Det tager endnu længere tid at afdække dens skjulte teknik. Jeg har arbejdet med det her hver dag i de sidste 15 år.
Hvor tæt er du på nogle løsninger?
Jeg er håbefuld, men jeg vil ikke være urealistisk. Vi er bestemt bedre stillet, end vi var for 15 år siden. Vi har nu lange lister over gener forbundet med autisme, og vi har dette nye værktøj til at studere dem. Men vi skal stadig forstå, hvordan de muterede gener får tingene til at gå galt i hjernen, så vi kan bygge effektive lægemidler.
Din historie begynder i Rumænien for 20 år siden, da du ikke vidste, hvad du skulle sige til forældre til børn med autisme. Hvis du tog tilbage til det land nu, hvad ville du så sige?
Alt, hvad jeg ærligt kan sige, er, at jeg er håbefuld. Vi er stadig langt væk fra en kur. På den anden side har der været store gennembrud inden for andre tilsyneladende uopløselige sygdomme i de senere år. Det giver mig et enormt håb.
