RALEIGH – Nimetage seda CRISPR-i mõistatuseks.
Bakterid kasutavad CRISPR-Cas süsteeme adaptiivse immuunsüsteemina, et seista vastu vaenlaste, näiteks viiruste, rünnakutele. Teadlased on neid süsteeme kohandanud, et eemaldada või lõigata ja asendada spetsiifilisi geneetilisi koodijärjestusi erinevates organismides.
[CRISPR-Cas on riikliku terviseinstituudi andmetel enamikus bakterites ja arhees esinev adaptiivne immuunsüsteem, mis hoiab ära nende nakatumise faagide, viiruste ja muude võõraste geneetiliste elementidega.]
Rodolphe Barrangou (NCSU foto)
Kuid uues uuringus näitavad Põhja-Carolina osariigi ülikooli teadlased, et CRISPR-Cas süsteemiga loodud viirused võivad takistada bakterite kaitsevõimet ja teha sihitud bakteris selektiivseid muudatusi – isegi kui teised bakterid on vahetus läheduses.
“Viirused on kasuliku koorma kohaletoimetamisel väga head. Siin kasutame CRISPR-i bakteritele viimiseks bakteriviirust, bakteriofaagi, mis on irooniline, sest tavaliselt kasutavad bakterid CRISPR-i viiruste hävitamiseks,“ ütles ta. Rodolphe Barrangou, Todd R. Klaenhammer, NC osariigi toiduainete, biotöötluse ja toitumisteaduste austatud professor ning täna aastal avaldatud uurimistööd kirjeldava artikli vastav autor. Proceedings of the National Academy of Sciences. "Viirus on antud juhul sihikule E. coli kohaletoimetades DNA-d. See on nagu viiruse kasutamine süstlana.
NC osariigi teadlased kasutasid kahte erinevat konstrueeritud bakteriofaagi, et tarnida CRISPR-Cas kasulikku koormust sihipäraseks redigeerimiseks. E. coli, esmalt katseklaasis ja seejärel pinnase jäljendamiseks loodud sünteetilises pinnaskeskkonnas – keerulises keskkonnas, mis võib sisaldada mitut tüüpi baktereid.
Mõlemad konstrueeritud bakteriofaagid nimega T7 ja lambda leidsid edukalt üles ja toimetasid seejärel kasuliku koormuse E. coli peremees laboripingil. Need kasulikud koormused ekspresseerisid bakterite fluorestseeruvaid geene ja manipuleerisid bakteri resistentsusega antibiootikumi suhtes.
Seejärel kasutasid teadlased lambda-d, et toimetada nn tsütosiini baasredaktoriga E. coli peremees. CRISPR-i DNA järjestuste mõnikord karmi lõikamise asemel muutis see baasredaktor vaid ühte tähte E. coli's DNA, mis näitab süsteemi tundlikkust ja täpsust. Need muutused inaktiveerisid teatud bakterigeenid, muutmata neid E. coli.
"Kasutasime siin põhiredaktorit omamoodi programmeeritava sisse-välja lüliti geenide jaoks E. coli. Kasutades sellist süsteemi, saame teha genoomis ülitäpseid ühetähelisi muudatusi ilma kaheahelalise DNA katkemiseta, mida tavaliselt seostatakse CRISPR-Cas sihtimisega,“ ütles Matthew Nethery, endine NC osariigi doktorant. üliõpilane ja uuringu juhtiv autor.
Lõpuks demonstreerisid teadlased kohapealset redigeerimist, kasutades valmistatud ökosüsteemi (EcoFAB), mis oli koormatud liiva ja kvartsi sünteetilise pinnasega koos vedelikuga, et jäljendada mullakeskkonda. Uurijad kaasasid ka kolme erinevat tüüpi baktereid, et kontrollida, kas faag suudab konkreetselt lokaliseerida E. coli süsteemi sees.
"Laboris võivad teadlased asju liiga lihtsustada," ütles Barrangou. "Eelistatav on keskkonda modelleerida, seega tahtsime katseklaasis supi asemel uurida reaalseid keskkondi."
Teadlased sisestasid lambda valmistatud ökosüsteemi. See näitas leidmisel head efektiivsust E. coli ja sihipäraste geneetiliste muutuste tegemine.
"See tehnoloogia võimaldab meie meeskonnal ja teistel avastada peamiste bakterite interaktsioonide geneetilisi aluseid taimede ja teiste mikroobidega kõrgelt kontrollitud laborikeskkondades, näiteks EcoFAB-des," ütles energeetikaministeeriumi Lawrence Berkeley riikliku labori teadlane Trent Northen. (Berkeley Lab), kes teeb koostööd Barrangouga.
"Me näeme seda mehhanismina mikrobioomi abistamiseks. Saame konkreetset bakterit muuta ja ülejäänud mikrobioom jääb puutumata, ”ütles Barrangou. „See on tõestus kontseptsioonist, mida saab kasutada igas keerulises mikroobikoosluses, mis võib tähendada paremat taimetervist ja seedetrakti paremat tervist – toidu ja tervise seisukohalt olulist keskkonda.
"Lõppkokkuvõttes esindab see uuring CRISPR-i kohaletoimetamise järgmist peatükki - viiruste kasutamine CRISPR-i masinate kohaletoimetamiseks keerulises keskkonnas."
Teadlased kavatsevad seda tööd jätkata, katsetades faagi CRISPR tehnikat teiste mullaga seotud bakteritega. Oluline on see, et see illustreerib, kuidas mulla mikroobikooslusi saab manipuleerida, et kontrollida valmistatud ökosüsteemides taimedega seotud bakterite koostist ja funktsiooni, et mõista, kuidas tõhustada taimede kasvu ja edendada taimetervist, mis pakub säästva põllumajanduse jaoks laialdast huvi.
Rahastas m-CAFEs Microbial Community Analysis & Functional Evaluation in Soils, teaduse fookusvaldkond, mida juhib Lawrence Berkeley riiklik labor ja mida toetas USA energeetikaosakond lepingu nr. DE-AC02-05CH11231 koostöös, sealhulgas UC Berkeley ja Innovatiivse Genoomika Instituudiga. Töö kaasautorite hulka kuuluvad Nethery, endine NC osariigi järeldoktorant Claudio Hidalgo-Cantabrana ja NC osariigi kraadiõppur Avery Roberts.
(C) NCSU
