RALEIGH – Kutsu sitä CRISPR-ongelmaksi.
Bakteerit käyttävät CRISPR-Cas-järjestelmiä adaptiivisina immuunijärjestelminä vastustaakseen vihollisten, kuten virusten, hyökkäyksiä. Tiedemiehet ovat mukauttaneet näitä järjestelmiä poistamaan tai leikkaamaan ja korvaamaan tiettyjä geneettisiä koodisekvenssejä useissa eri organismeissa.
[CRISPR-Cas on mukautuva immuunijärjestelmä, joka esiintyy useimmissa bakteereissa ja arkeissa, mikä estää niitä tartuttamasta faageja, viruksia ja muita vieraita geneettisiä elementtejä National Institute of Healthin mukaan.]
Rodolphe Barrangou (NCSU-kuva)
Mutta uudessa tutkimuksessa North Carolina State Universityn tutkijat osoittavat, että CRISPR-Cas-järjestelmällä muokatut virukset voivat estää bakteerien puolustuskyvyn ja tehdä valikoivasti muutoksia kohdebakteeriin – vaikka muut bakteerit olisivat lähellä.
”Virukset ovat erittäin hyviä kuljettamaan hyötykuormia. Täällä käytämme bakteerivirusta, bakteriofagia, kuljettamaan CRISPR:ää bakteereille, mikä on ironista, koska bakteerit käyttävät tavallisesti CRISPR:ää virusten tappamiseen", sanoi Rodolphe Barrangou, Todd R. Klaenhammer NC Staten elintarvike-, biokäsittely- ja ravitsemustieteiden arvostettu professori ja vastaava kirjoittaja tänään vuonna julkaistussa tutkimuksessa. Proceedings of National Academy of Sciences. "Virus tässä tapauksessa kohdistuu E. coli toimittamalla siihen DNA:ta. Se on kuin käyttäisi virusta ruiskuna."
NC State -tutkijat käyttivät kahta erilaista muokattua bakteriofagia toimittaakseen CRISPR-Cas-hyötykuormia kohdennettua editointia varten. E. coli, ensin koeputkessa ja sitten synteettisessä maaperässä, joka on luotu jäljittelemään maaperää – monimutkainen ympäristö, jossa voi olla monenlaisia bakteereja.
Molemmat muokatut bakteriofagit, nimeltään T7 ja lambda, löysivät onnistuneesti ja toimittivat hyötykuormat E. coli isäntä laboratoriopenkillä. Nämä hyötykuormat ilmensivät bakteerien fluoresoivia geenejä ja manipuloivat bakteerin vastustuskykyä antibiootille.
Sitten tutkijat käyttivät lambdaa toimittamaan niin kutsutun sytosiinipohjaeditorin E. coli isäntä. CRISPR:n joskus ankaran DNA-sekvenssien pilkkomisen sijaan tämä peruseditori muutti vain yhden kirjaimen E. coli 's DNA, joka osoittaa järjestelmän herkkyyden ja tarkkuuden. Nämä muutokset inaktivoivat tiettyjä bakteerigeenejä tekemättä muita muutoksia E. coli.
"Käytimme tässä peruseditoria eräänlaisena ohjelmoitavana on-off-kytkimenä geenien sisääntulolle E. coli. Käyttämällä tällaista järjestelmää voimme tehdä erittäin tarkkoja yksikirjaimia muutoksia genomiin ilman kaksijuosteisen DNA:n katkeamista, joka yleensä liittyy CRISPR-Cas-kohdistukseen", sanoi Matthew Nethery, entinen NC State Ph.D. opiskelija ja tutkimuksen johtava kirjoittaja.
Lopuksi tutkijat osoittivat paikan päällä tapahtuvaa muokkausta käyttämällä valmistettua ekosysteemiä (EcoFAB), joka oli ladattu synteettisellä maaperällä, jossa oli hiekkaa ja kvartsia sekä nestettä, matkimaan maaperää. Tutkijat ottivat mukaan myös kolme eri tyyppistä bakteeria testatakseen, voisiko faagi paikantaa E. coli järjestelmässä.
"Laboratoriossa tutkijat voivat yksinkertaistaa asioita liikaa", Barrangou sanoi. "Ympäristöjä kannattaa mallintaa, joten halusimme koeputkessa keiton sijaan tutkia tosielämän ympäristöjä."
Tutkijat lisäsivät lambdan valmistettuun ekosysteemiin. Se osoitti hyvää tehokkuutta etsimisessä E. coli ja kohdennettujen geneettisten muutosten tekeminen.
"Tämä teknologia antaa tiimillemme ja muille mahdollisuuden löytää geneettisen perustan keskeisille bakteerivuorovaikutuksille kasvien ja muiden mikrobien kanssa tarkasti valvotuissa laboratorioympäristöissä, kuten EcoFAB:issa", sanoi Trent Northen, tiedemies Energy Departmentin Lawrence Berkeley National Laboratorysta. (Berkeley Lab), joka tekee yhteistyötä Barrangoun kanssa.
"Näemme tämän mekanismina, joka auttaa mikrobiomia. Voimme tehdä muutoksen tiettyyn bakteeriin ja loput mikrobiomista säilyvät vahingoittumattomina, Barrangou sanoi. "Tämä on todiste konseptista, jota voitaisiin käyttää missä tahansa monimutkaisessa mikrobiyhteisössä, mikä voisi johtaa parempaan kasvien terveyteen ja ruoansulatuskanavan terveyteen - elintarvikkeiden ja terveyden kannalta tärkeisiin ympäristöihin.
"Tämä tutkimus edustaa viime kädessä CRISPR-toimituksen seuraavaa lukua – virusten käyttöä CRISPR-koneiden toimittamiseen monimutkaisessa ympäristössä."
Tutkijat aikovat jatkaa tätä työtä testaamalla faagi-CRISPR-tekniikkaa muilla maaperään liittyvillä bakteereilla. Tärkeää on, että tämä havainnollistaa, kuinka maaperän mikrobiyhteisöjä voidaan manipuloida kasveihin liittyvien bakteerien koostumuksen ja toiminnan hallitsemiseksi valmistetuissa ekosysteemeissä, jotta voidaan ymmärtää, kuinka parantaa kasvien kasvua ja edistää kasvien terveyttä, mikä on laajaa mielenkiintoa kestävän maatalouden kannalta.
Rahoitusta myönsi m-CAFEs Microbial Community Analysis & Functional Evaluation in Soils, Lawrence Berkeley National Laboratoryn johtama tieteen fokusalue ja jota Yhdysvaltain energiaministeriö tuki sopimuksen nro. DE-AC02-05CH11231, yhteistyössä UC Berkeleyn ja Innovative Genomics Instituten kanssa. Paperin kirjoittajia ovat Nethery, entinen NC State post-doc-tutkija Claudio Hidalgo-Cantabrana ja NC State jatko-opiskelija Avery Roberts.
(C) NCSU
