La microscopie à expansion permet la nanoimagerie avec un microscope conventionnel

La microscopie d'expansion est une technique d'imagerie biologique qui permet l'imagerie à l'échelle nanométrique à l'aide d'un microscope à fluorescence à diffraction limitée conventionnel. Il fonctionne en incorporant des échantillons dans un hydrogel gonflable à l'eau, puis en dilatant le gel. Cela éloigne physiquement les biomolécules les unes des autres, permettant leur interrogation à une résolution auparavant uniquement réalisable en utilisant des techniques d'imagerie haute résolution coûteuses.

Les protocoles de microscopie d'expansion actuels, cependant, ne sont pas optimisés pour une adoption généralisée. Les échantillons doivent être traités avec des agents d'ancrage personnalisés pour lier des biomolécules et des étiquettes spécifiques à l'hydrogel. En outre, la plupart des approches n'ont atteint qu'une expansion tissulaire d'environ quatre fois, limitant la résolution effective à environ 70 nm sur un microscope optique conventionnel avec une lentille d'objectif à diffraction limitée à 280 nm.

Pour pallier ces lacunes, une équipe dirigée par Carnegie Mellon University a développé une nouvelle stratégie de microscopie d'expansion appelée Magnify. Le protocole décrit dans Nature Biotechnology, utilise un nouvel hydrogel mécaniquement robuste qui retient un spectre de biomolécules sans nécessiter une étape d'ancrage séparée.

Magnify peut agrandir les échantillons jusqu'à 11 fois, permettant l'imagerie des cellules et des tissus avec une résolution effective d'environ 25 nm à l'aide d'un microscope conventionnel. Lorsqu'il est combiné avec l'imagerie par fluctuation optique à super-résolution (SOFI, une méthode de post-traitement informatique), il atteint une résolution effective d'environ 15 nm.

Les protocoles de microscopie d'expansion précédents nécessitaient également l'élimination de nombreuses biomolécules qui maintiennent les tissus ensemble. "Pour rendre les cellules vraiment expansibles, vous devez utiliser des enzymes pour digérer les protéines, donc au final, vous aviez un gel vide avec des étiquettes qui indiquent l'emplacement de la protéine d'intérêt", explique l'auteur principal. Yongxin Zhao Dans un communiqué de presse.

« L'un des principaux arguments de vente de Magnify est la stratégie universelle consistant à conserver les biomolécules des tissus, y compris les protéines, les acides nucléiques et les glucides, dans l'échantillon expansé. Les molécules sont conservées intactes et plusieurs types de biomolécules peuvent être marqués dans un seul échantillon », ajoute Zhao.

Applications larges

Zhao et ses collègues ont appliqué Magnify à un large éventail de types de tissus. L'imagerie d'une section de cerveau de souris élargie 11 fois colorée pour la teneur totale en protéines, par exemple, a permis la visualisation de l'architecture nanoscopique des synapses individuelles dans le cerveau. Magnify a démontré un pouvoir de résolution efficace d'environ 18 nm en utilisant une lentille d'objectif ×60 (limite de diffraction d'environ 200 nm).

Les chercheurs ont confirmé la faible distorsion obtenue par le protocole Magnify sur plusieurs types de tissus, en utilisant la pré-expansion SOFI et la microscopie confocale post-expansion. Ils n'ont trouvé aucun changement morphologique substantiel entre les images pré- et post-expansion des noyaux cellulaires et des marqueurs protéiques aux niveaux macroscopiques ou de sous-diffraction.

L'équipe a également testé Magnify sur une gamme d'échantillons fixés au formol et inclus en paraffine - qui comptent parmi les préparations de biopsie les plus importantes, mais qui sont difficiles à développer avec les protocoles actuels. Cela comprenait des coupes de tissus de rein, de sein, de cerveau et de côlon, et des tumeurs correspondantes. Magnify pourrait élargir les échantillons par des facteurs d'environ 8.00 à 10.77 dans l'eau, selon le type de tissu.

L'un des principaux objectifs était de rendre Magnify adapté à une large gamme d'échantillons de tissus, facilitant ainsi son adoption par les chercheurs souhaitant adopter le nouveau protocole. "Cela fonctionne avec différents types de tissus, méthodes de fixation et même des tissus qui ont été préservés et stockés", déclare le co-premier auteur Brendan Gallagher. « Il est très flexible, dans la mesure où vous n'avez pas nécessairement besoin de reconcevoir complètement les expériences avec Magnify à l'esprit ; cela fonctionnera avec ce que vous avez déjà.

Augmenter la résolution

Pour démontrer l'augmentation supplémentaire de la résolution effective rendue possible par l'association de Magnify avec SOFI, les chercheurs ont utilisé la combinaison pour imager les organoïdes pulmonaires humains, en particulier les cils qui fonctionnent pour éliminer le mucus dans les voies respiratoires. Avec un diamètre de 200 nm et une longueur de seulement quelques micromètres, ces structures sont généralement trop petites pour être vues sans utiliser une technologie telle que la microscopie électronique (EM).

Magnify-SOFI pourrait résoudre complètement la structure creuse des cils et des corps basaux, y compris l'anneau externe précédemment montré par EM comme comprenant neuf faisceaux de microtubules. Les chercheurs ont estimé la résolution effective à environ 14-17 nm (en utilisant une lentille d'objectif à diffraction limitée à 280 nm). Ils ont également pu visualiser les défauts des cils dans les cellules pulmonaires présentant des mutations génétiques.

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"Avec les dernières techniques Magnify, nous pouvons étendre ces tissus pulmonaires et commencer à voir une ultrastructure des cils mobiles même avec un microscope ordinaire, ce qui accélérera les investigations de base et cliniques", commente le co-auteur. Xi Ren.

S'appuyant sur le développement réussi de Magnify, l'équipe l'utilise maintenant pour étudier des échantillons de tissus encore plus complexes. "Cela inclut l'exploration de tissus infectés ainsi que de spécimens plus grands tels que des organes entiers", a déclaré Zhao. Monde de la physique. "De plus, nous travaillons à l'optimisation de Magnify pour étudier des échantillons humains pathologiques et étudier les changements à l'échelle nanométrique dans le cerveau au cours des processus d'apprentissage et des maladies. Avec ces percées, de nouvelles découvertes peuvent être attendues dans ce domaine d'étude très prometteur.

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• La source: https://physicsworld.com/a/expansion-microscopy-enables-nanoimaging-with-a-conventional-microscope/