A küldetésnyilatkozat a Stanford Egyetem laboratóriumának honlapján Sergiu Paşca egyszerre egyszerű és látványosan ambiciózus. Csoportja „igyekszik megérteni azokat a szabályokat, amelyek szabályozzák az emberi idegrendszer felépítésének alapjául szolgáló molekuláris és sejtszintű lépéseket, valamint azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek neurológiai és pszichiátriai betegségekhez vezetnek”.
Paşca e cél felé választott útvonala az őssejttechnológia fejlett formáját használja. Először is, genetikailag átprogramozza az autisták és a skizofréniához hasonló betegségekben szenvedő betegek bőrsejtjeit, hogy sokoldalú őssejtekké váljanak; majd arra készteti a sejteket, hogy egy laboratóriumi edényben idegszövetként meghatározottabb állapotba rendeződjenek. A sejtek működésének vagy hibás működésének megfigyelésével Paşca, a Stanford pszichiátriai és viselkedéstudományi professzora és a Wu Tsai Neurosciences Institute igazgatója betekintést nyer abba, hogy mitől különbözik a neurológiai betegségekben szenvedők agya.
Annak érdekében, hogy ezeket a modellrendszereket élethűbbé tegye, fantasztikusnak tűnő tudományos újításokat hozott létre. Palo Alto-i laboratóriumában Paşca miniatűr gömb alakú szöveteket vagy organoidokat hozott létre, amelyek az emberi agy különböző régióira hasonlítanak. Kollégáival az agy, a gerincvelő és az izomszövetek organoidjait „szerelvényekké” kapcsolták össze, amelyek parancsra képesek megrándulni.
És új munka Ma bejelentették, hogy Paşca csapata kimutatta, hogy a fiatal patkányok fejlődő agyába bevitt emberi organoidok spontán módon szétterülhetnek, és beépülhetnek az állat idegrendszerébe – ez az eredmény utat mutat az emberi agy kutatási modelljei felé, amelyek egyre inkább terjednek. élethű, de praktikus és etikus a munka.
Amikor a New York-i Vilcek Alapítvány odaítélte Paşcának az orvosbiológiai tudomány kreatív ígéretéért járó 2018-as díjat, ezt azért tették, mert „erõfeszítései a páciensekbõl származó agyi kultúrák tárházához vezettek, amelyek az agyfejlõdés legrealisztikusabb modelljei, amelyek ma a kutatók rendelkezésére állnak. .”
Posztdoktori tanácsadója szerint Ricardo Dolmetsch, a uniQure génterápiás vállalat kutatási és fejlesztési részlegének elnöke: „Sergiu munkája felveti annak lehetőségét, hogy egy napon képesek leszünk hiányzó agysejteket átültetni beteg emberekbe, vagy kifejleszteni a neurológiai vagy pszichiátriai betegségek laboratóriumi modelljeit, amelyeket felhasználhatunk gyógyszereket fejleszteni."
A múlt nyáron beszélgettünk Paşcával a Zoomon és telefonon. Az interjúkat az egyértelműség kedvéért sűrítettük és szerkesztettük.
Mindig is szeretett volna tudományos kutatást végezni?
Fiatal kortól. Igen.
Romániában nőttem fel, egy erdélyi kisvárosban. Gyerekkoromban laboratóriumot építettem a családi házam pincéjében. A növények növekedését úgy próbálnám javítani, hogy különböző vegyszereket adnék a talajhoz, majd mérem a hatásukat. Egyszer hozzáadtam egy réz alapú molekulát. Ez okozta az egyik növényem 20%-os növekedését. Ez lekötött a kutatásban.
És ma idegsejteket növeszt egy laboratóriumban. Hogyan jött ez?
[Nevet.] Ez egy hosszú történet. A Ceauşescu-diktatúra megdöntése utáni években jártam iskolába. Akkoriban Románia a diktatúra hosszú távú hatásaitól – elszigeteltségtől, fejletlenségtől – szenvedett. A középiskola végén díjat nyertem egy országos kémiaversenyen. A díjat bármely romániai egyetemre való felvételivel járták. A kolozsvári Iuliu Haţieganu Orvostudományi Egyetemet választottam. Az volt az ötlet, hogy orvos-kutató legyek. Akkor is azt hittem, és most is érzem, hogy a világnak többre van szüksége belőlük.
Sajnos egyszer az orvosi egyetemen rájöttem, hogy kevés a forrás: nincs támogatás, nincs reagens a labormunkához. De volt egy nagyon elkötelezett professzorom, és ő 200 eurót használt fel a saját pénzéből – akkoriban egy vagyont – egy kis reagenskészlet megrendelésére Németországból. Ezután egy évre terveztük, hogyan használjuk a legjobban.
És így jutott eszembe először az agyi rendellenességek tanulmányozása. Azt fontolgattam, hogy ezt a reagenskészletet használom szív- és érrendszeri betegségben szenvedő betegek vérében lévő metabolitok vizsgálatára. De ahhoz, hogy bármit megtanuljak, több száz, esetleg több ezer beteget kell tesztelnem. Csak 50 reakcióhoz volt elegendő reagensünk!
Egyik nap, amikor egy statisztika órán jártam, megütött a fejem: Az egyetlen módja annak, hogy vizsgálatot végezzünk egy kis betegcsoporttal, ha megvizsgálunk egy ritka betegséget. Arra gondoltam: autizmus.
Autizmus? Nem olyan ritka – 50-ből egynek van valamilyen formája.
20 évvel ezelőtt ezt nem tudtuk.
Az volt az ötletem, hogy megnézzük, találunk-e az állapot jeleit az autista gyerekek vérében. A vizsgálat elvégzéséhez meg kellett győznöm a szülőket, hogy adjanak kis mennyiségű vért gyermekeik véréből. A velük való beszélgetés szívszorító volt. Felnyitotta a szemem a hatalmas szenvedések előtt, amelyeken a családok átmentek. A szülők csodálkoztak: „Mi okozhatta ezt?”
Csak annyit tudtam mondani: „Semmi sem ismert”.
Hogy jobb válaszokat tudjak adni, jelentkeztem egy bukaresti tanfolyamra, amelyet a Nemzetközi Agykutatási Szervezet, az IBRO kínált. Amerikai és brit idegtudósok voltak, akik a fejlett agytudományt próbálták elhozni az elszigetelt országokba. Előadásaik világossága és az általuk leírt idegtudományi felfedezések szépsége rendkívül izgatott.
Az órákon megismerhettem Jack McMahant, a stanfordi neurobiológiai program egyik alapítóját. Maradtunk kapcsolatban, és később segített Kaliforniába jönni.
Mi lett a metabolitvizsgálatoddal?
Felfedeztük, hogy egyes autista betegek egyszén-anyagcseréjében rendellenességek mutatkoztak. Ez a folsavtól és B-vitaminoktól függő útvonal kissé zavart volt, és ez valószínűleg genetikai és táplálkozási tényezők kombinációjával volt összefüggésben.
Mire befejeztem az orvosi egyetemet, számos dolgozatot publikáltam az autizmusról. Jack McMahan elolvasta őket, és azt mondta: „Miért nem jössz Stanfordba? Van egy kollégám, aki szeretné a laborját ebbe az irányba mozgatni.” Ez volt Ricardo Dolmetsch, aki néhány évvel később a Novartis Institutes for Biomedical Research idegtudományi vezetője lett.
Eltartott egy darabig, mire megkaptam a finanszírozást, de végül megkaptam egy IBRO-ösztöndíjat, és eljöttem Palo Altóba.
Mi volt a feladatod a Dolmetsch laboratóriumban?
Új megközelítés kialakítása az emberi agy megismeréséhez.
Néhány évvel korábban Shinya Yamanaka, a San Francisco-i Kaliforniai Egyetem és a Kiotói Egyetem munkatársa kitalálta, hogyan lehet egerekből bőrsejteket venni, és újraprogramozni őket, hogy újra indukált pluripotens őssejtekké, azaz iPS-sejtekké alakuljanak. Az őssejtek sokféle sejtbe koaxolhatók, beleértve a neuronokat, az idegrendszer építőköveit. Yamanaka ezért Nobel-díjat kapna.
Ricardo laboratóriumában azt terveztem, hogy módot találok az emberi iPS-sejtek neuronokká alakítására. Az ötlet az volt, hogy autista gyerekek bőrsejtjeit nyerjék vissza, majd alakítsák vissza őket őssejtekké, majd irányítsák őket neuronokká egy Petri-csészében. Ha sikerült, reméltük, hogy átugorjuk azokat az akadályokat, amelyek megakadályoztak bennünket abban, hogy teljesen megértsük, hogyan fejlődik az emberi idegrendszer. Ez egy mód a neuropszichiátriai állapotok, például az autizmus, az epilepszia és a skizofrénia biológiai alapjainak pontosabb megértésére.
Mik ezek az akadályok?
A fő probléma az emberi agy elviselhetetlen hozzáférhetetlensége.
Ha valami elromlik a lépben vagy a májban, az orvosok biopsziát vesznek, és elemzik a szövetet. Ez a gyakorlat forradalmasította az orvostudományt. A kutatóknak sikerült kivenniük a betegek sejtjeit, egy edénybe tenni, azonosítani a hibás működési mechanizmusokat, és különböző vegyületekkel helyreállítani őket. Így fedeztek fel új gyógyszereket.
De ritka helyzetek kivételével nem fúrjuk át egy élő ember koponyáját, hogy közvetlenül tanulmányozzuk az emberi agyszövetet. Az orvosi kockázatok mellett mély kulturális tabuk is vannak. Hajlamosak vagyunk az agyat „velünk” társítani, azzal, akik vagyunk. Az agy közvetlen megérintésével ezeket a módszereket úgy tekintik, mint amelyek beavatkoznak az „én”-be.
Visszagondolva az orvosi egyetemen végzett klinikai rotációimra, szinte irigykedtem az onkológiai osztályon dolgozó kollégáimra. A molekuláris biológiai forradalom az őket érdeklő rákos szövetek hozzáférhetőségével kombinálva azt jelentette, hogy új kezelések vártak rájuk. Elképesztő dolgok történtek például a leukémiával.
Az autizmussal semmink nem volt. Nem tudtuk azonosítani a problémákat okozó mechanizmusokat, mert nem tudtuk közvetlenül tanulmányozni az agyszövetet. És még ha tehetnénk is, nem tudtuk volna, mit keressünk.
Nem tudnád tanulmányozni a boncolásból nyert emberi agyszövetet?
A halál utáni agy keveset árul el az élő neuronok elektromos aktivitásáról. Mérni kell ezt a tevékenységet, mert az agy neuronjai ezt teszik: elektromos jeleket bocsátanak ki.
Ami az állatmodelleket illeti, korlátai vannak a pszichiátriai rendellenességek vizsgálatakor. Az emberi agy bonyolultabb, mint az egerek vagy akár a makákók agya. Több millió éves evolúció választ el minket ezektől az állatoktól. Számtalan példát láttunk olyan gyógyszerekre, amelyek nagyon sikeresek voltak rágcsálókban, majd kudarcot vallottak az embereken végzett klinikai vizsgálatok során.
Arra gondoltam, hogy előrébb vihetjük a dolgokat, ha magunk készítünk élő emberi agyszövetet.
Biztosan ellentmondásos volt az ötleted.
Ó, igen. Voltak, akik azt hitték, hogy ez nem fog menni. Azt gondolták, hogy a bőrsejtek átalakításával elveszíti a betegség patofiziológiáját, és akkor nem tudunk semmi újat felfedezni.
Nyolc hónapon belül azonban olyan őssejtekből származó emberi neuronjaink voltak, amelyek az autizmus genetikai formájával rendelkező betegek bőréből indultak ki. A mikroszkóp alatt nézegetve láthatta, hogy kalciumjeleket sugároznak. Elindultunk valahova.
Hogyan lehet neuronokat létrehozni?
A sejtek újraprogramozása őssejteket nyert a bőrsejtekből. Ezután koaxáltuk az őssejteket, hogy más típusú sejtekké differenciálódjanak.
Az őssejtek szeretnek differenciálódni. Más típusú sejtté kell alakulniuk. És valójában nagy a valószínűsége annak, hogy szinte alapértelmezés szerint neuronokká válnak. Nem kell annyit tennie, hogy neuronokat hozzon létre, bár ezek irányítása segít. Amit tesz, az az, hogy az őssejteket tartalmazó tápközeget olyan molekulákkal tölti fel, amelyek elősegítik az átalakulást. Néha elvisz néhány molekulát is.
Hamarosan milliónyi gyönyörű neuronunk volt. A rossz hír az volt, hogy idegsejtjeink egyetlen sejtrétegben megtapadtak egy Petri-csésze alján, ahol hetekig tartó tenyésztés után elapadtak. Ha fel akarjuk deríteni, mi történik az emberi aggyal, amint az hónapok alatt fejlődik, hosszabb ideig tartó idegsejtekre van szükségünk.
Volt egy ötletem. Vettem egy tapadásmentes anyaggal bevont műanyag laboratóriumi edénykészletet, és ezekben növesztettük a sejteket. Elképesztő módon a gambit működött! A sejtek nem tudtak az edényhez tapadni. Ehelyett a közegben lebegtek, fenntartva őket, és kis, borsó méretű golyókká halmozódtak.
Eleinte ezeket a lebegő sejtcsomókat szferoidoknak neveztük. Később organoidok néven váltak ismertté – valami, ami hasonlít egy bizonyos szervre, de nem az.
Miben különböztek ezekben a golyókban lévő sejtek az ön magányos neuronjaitól?
Háromdimenziós térben nőttek. Körbejártak és kommunikáltak egymással. Fontos, hogy hosszabb ideig is eltarthatók egy edényben.
Megfelelő körülmények között az organoidokat 900 napig megőrizhetjük. És ez lehetővé tette számunkra, hogy új dolgokat figyeljünk meg. Például körülbelül kilenc-tíz hónapos korban a sejtek inkább posztnatális neuronokká váltak, mint prenatálisakhoz. Úgy tűnt, érzik az idő múlását, és azt, hogy ez mit jelent a fejlődésük szempontjából.
Mennyire voltak hasznosak az organoidok a kutatásában?
Hadd meséljek el egy kísérletet, amelyet velük végeztünk.
Létezik egy genetikai betegség, a 22q11.2-deléciós szindróma, amely a 22. kromoszóma egy részének elvesztésével jár. A betegeknél 30-szorosára nő a skizofrénia kockázata. Autizmus vagy más neuropszichiátriai rendellenesség is kialakulhat bennük. Toboroztunk 15 beteget és 15 egészséges kontrollt, és elkezdtük az agykéreghez hasonló neuronok előállítását az általuk adományozott bőrből. Láttuk, hogy a betegek neuronjai abnormális elektromos tulajdonságokkal rendelkeznek. Nem tudtak megfelelően kommunikálni egymással.
Manapság a skizofréniát gyakran antipszichotikus gyógyszerekkel kezelik. Néhány ilyen gyógyszert egy edénybe tettünk, amelyben a pácienseink sejtjeiből készült kérgi organoidok voltak, és láttuk, hogy az antipszichotikumok megfordították a neuronok elektromos tulajdonságaival kapcsolatos problémát.
Ez azt jelentette, hogy most már lehetőségünk van egy edényben tesztelni ezeket a gyógyszereket.
Az organoidokról beszéltél. De mik is azok az assembloidok?
Az Assembloid egy új modellrendszer, amelyet hat-hét évvel ezelőtt találtunk ki. Ezek háromdimenziós sejttenyésztő rendszerek, amelyek legalább két különböző típusú organoidból épülnek fel, vagy organoidokat kombinálnak más speciális sejttípusokkal. Ezeket összerakva új sejttulajdonságokat láthatunk, amelyek szoros kölcsönhatásukból fakadnak.
Összehelyezhet két különböző agyi régióra emlékeztető organoidot, és megnézheti, hogyan vetülnek egymáshoz a neuronok, majd kapcsolódnak össze, hogy áramköröket képezzenek. Vagy kombinálhatja az organoidokat az immunsejtekkel, és megvizsgálhatja a betegségek neuroimmun kölcsönhatásait.
Például van egy ritka típusú autizmus, amely a Timothy-szindrómának nevezett genetikai rendellenességhez kapcsolódik. Ezt a kalciumcsatornát kódoló gén egybetűs mutációja okozza. Túl sok kalcium juthat be a sejtekbe, amikor elektromos jeleket kapnak. Ez megzavarja a kémiai jelek átvitelét az idegsejteken és más ingerlékeny sejteken belül.
Bőrsejteket vettünk a Timothy-szindrómás betegektől, gyűjtöttünk összeszerelvényeket, majd megfigyeltük, mi történik bennük. Láthattuk, hogy a betegek sejtjéből kinőtt neuronok gyakrabban mozogtak, de rövidebb távolságra mozogtak, mint az egészséges kontrollcsoport neuronjai. A betegek sejtjei végül elmaradtak a szervezetükben.
Izgalmas lehetett ennek valós időben szemtanúja lenni.
Láthattad! Szó szerint a saját szemeddel láthattad!
Nálunk ez a festék a kalciumot színezte. Abban a pillanatban, amikor a kalcium bejutott a sejtekbe, láthatta, hogy a színek felfelé és lefelé mennek, mérve, hogy mennyi kalcium jutott a sejtbe. Több volt belőle a betegek sejtjeiben.
Hat évet töltöttünk azzal, hogy pontosan kitaláljuk, hogy ez a kalciumcsatorna miként okoz hibákat ezen specifikus típusú neuronok mozgásában. A betegek mutált csatornája két különböző molekuláris útvonalat érint az idegsejtekben. Fontos, hogy azt találtuk, hogy két különböző gyógyszerre van szüksége az aktivitás helyreállításához. Úgy gondoljuk, hogy most már megvan az alapja annak, ami a jövőben elvezethet bennünket egy kezelésig.
Soha nem tudtuk volna megtanulni ezt a assembloidok nélkül, mert a sejteknek három dimenzióban kell kölcsönhatásba lépniük a rögzítéshez.
Új cikkében bejelenti, hogy a laboratóriuma létrehozott egy patkányt, amelyben az emberi neuronok az állat kéregének egyharmadát egy féltekén lefedik, és mélyen beépülnek az agyba. Miért kell létrehozni ezt a modellt?
Több mint egy évtizede készítjük el a kultúrákat egy olyan ételben, amely összefoglalja az emberi idegrendszer számos aspektusát. De vannak korlátai ezeknek a kultúráknak: az általunk készített neuronok nem nőnek olyan nagyra. Nincsenek viselkedési kimenetek, mint egy tényleges emberi agyban. És nem kapnak olyan szenzoros bemeneteket, amelyek befolyásolnák fejlődésüket – a kéregnek jeleket kell fogadnia. Megpróbáltunk valamilyen értelmes külső bemenetet biztosítani ezeknek az emberi neuronoknak.
Tehát a következő lépés az emberi neuronok növekedése volt egy patkány agyában. Elvettük az organoidokat és átültettük egy patkánykölyök agykéregébe. Az organoidot a patkány vaszkularizálta, és végül úgy nőtt, hogy lefedje agykérgi féltekéjének egyharmadát.
Azt hittem, nem rajongsz az emberi agykutatáshoz használt állatmodellekért. Mi történt?
Szerintem az állatmodellek és az emberi sejtmodellek kiegészítik egymást. Ebben az esetben az állatokba történő átültetés lehetővé teszi számunkra, hogy az emberi neuronokat olyan áramkörökbe integráljuk, amelyek segítségével megérthetjük ezeket a betegségeket és tesztelhetjük a gyógyszereket. Ez egy másik módja annak megértésének, hogy az emberi neuronok hogyan dolgozzák fel az információt az élő áramkörökben.
Tehát ezeknek az organoidokból származó emberi neuronoknak lehetőségük volt a patkány agyában növekedni, és képesek voltak bemeneteket és kimeneteket kapni az állatoktól. Hogyan viszonyulnak azokhoz a neuronokhoz, amelyek csak az organoidokon belül nőttek fel? És hogyan viszonyulnak a saját agyunkban növekvő neuronokhoz?
Az átültetett emberi neuronok körülbelül hatszor nagyobbak, mint a hasonló fejlettségű emberi neuronok, amelyeket egy edényben tartanak fenn. Elektrofiziológiailag érettebbek, több szinapszist alkotnak, és sokkal közelebb állnak a szülés utáni emberi agy neuronjaihoz.
Lát valamiféle viselkedésbeli különbséget ezekben a patkányokban, amelyek annyi emberi idegsejtre tettek szert?
Nem. Nincs különbség a kognitív és motoros feladatok között, amelyekben a patkányokat teszteltük. Mi is ellenőriztük, és nem tapasztalnak rohamokat. A patkányokat azonban meg lehet tanítani arra, hogy az emberi neuronok stimulálását a jutalom átadásával társítsák. Ez példátlan lehetőségeket kínál az emberi agyi rendellenességek tanulmányozására.
Mikor kell az Ön assmbleroidjainak és organoidjainak valamilyen törvényes joggal rendelkezniük?
Azt hiszem, az in vitro tenyészetek esetében ezek csak sejtcsoportok. Nem tekintjük őket agynak. Árnyaltabbá válik, ha állatokba való átültetésről van szó.
Hogyan vélekednek a bioetikusok a kísérleteiről?
Szorosan együttműködünk velük. Ezen az úton végig aktívan részt vettem a stanfordi és azon túli etikusokkal folytatott megbeszélésekben. Minden kísérletünket szorosan figyelemmel kísérjük, és etikusokkal megbeszéljük. A kísérleteket nem elszigetelten végezzük. A kísérleteket megvitatásuk előtt megbeszélik, és minden bizonnyal futás közben. Beszélünk a következményekről, az előnyökről és hátrányokról.
Gondoltál-e valaha arra, hogy a Frankenstein sztori?
sokat gondolkodom rajta. De úgy gondolom, hogy a történet nem annyira releváns a mai tudomány számára. A mai világban olyan technológiákat lehet fejleszteni, amelyek etikusak. Sok köze van a kutató indítékához. Hosszú távú célom az, hogy megtaláljam a kezelést és talán a gyógymódot ezekre az idegrendszeri fejlődési rendellenességekre. Ez volt az én északi csillagom.
Néhány évvel ezelőtt, mielőtt megkapta volna a CRISPR-ért járó Nobel-díjat, megkérdeztem Jennifer Doudnát, hogy nem aggasztja-e a génszerkesztő technológia esetleges visszaélése. Azt válaszolta, hogy aggasztja „egyes területeken az a vágy, hogy előrerohanjanak az emberi embriók megváltoztatása érdekében”. Nem sokkal később egy ambiciózus kutató Shenzhenben (Kína) bejelentette, hogy CRISPR-t használt két emberi csecsemő genetikai kódjának felülvizsgálatára. Aggódik valaha amiatt, hogy előveszi az újságot, és rájön, hogy valahol egy tudós az Ön munkáját felhasználta arra, hogy idő előtt előállítsa az emberi agy egyes részeit?
Nem. Az egyik dolog, ami megkülönbözteti az organoid munkát a CRISPR-től, a kísérletekhez szükséges erőforrások. A CRISPR-rel végzett génszerkesztés csak némi képzést és kevés erőforrást igényel. A konyhádban is megteheted! Az, amit csinálunk, sokkal több időt és pénzt igényel. A sejtek 900 napig tartó életben tartása meglehetősen drága, és speciális képzést és felszerelést igényel. Ez a tény önmagában ad némi lélegzetet, hogy feldolgozzuk felfedezéseinket és azok következményeit.
Kevés helyen van az ehhez szükséges infrastruktúra és szakértelem. Megpróbáljuk megismételni az emberi agy fejlődését, ami nagyon hosszú ideig tart. A rejtett tervezés feltárása még tovább tart. Az elmúlt 15 évben minden nap ezen dolgozom.
Mennyire vagy közel egyes megoldásokhoz?
Reménykedek, de nem akarok irreális lenni. Biztosan jobban vagyunk, mint 15 évvel ezelőtt. Hosszú listánk áll rendelkezésünkre az autizmussal kapcsolatos génekről, és van egy új eszközünk a tanulmányozásukra. De még mindig meg kell értenünk, hogy ezek a mutált gének hogyan okoznak rosszat az agyban ahhoz, hogy hatékony gyógyszereket építhessünk.
A történeted 20 évvel ezelőtt Romániában kezdődik, amikor nem tudtad, mit mondj az autista gyerekek szüleinek. Ha most visszamennél abba az országba, mit mondanál?
Csak annyit mondhatok őszintén, hogy reménykedem. Még mindig messze vagyunk a gyógyulástól. Másrészt az elmúlt években hatalmas áttörések történtek más, megoldhatatlannak tűnő betegségekben. Ez óriási reményt ad nekem.
