Mikroskop ekspansi memungkinkan pencitraan nano dengan mikroskop konvensional

Mikroskopi ekspansi adalah teknik pencitraan biologis yang memungkinkan pencitraan skala nano menggunakan mikroskop fluoresensi terbatas difraksi konvensional. Ini bekerja dengan menanamkan sampel dalam hidrogel yang dapat membengkak air dan kemudian memperluas gel. Ini secara fisik memperluas biomolekul dari satu sama lain, memungkinkan interogasi mereka pada resolusi yang sebelumnya hanya dapat dicapai dengan menggunakan teknik pencitraan resolusi tinggi yang mahal.

Namun, protokol mikroskop ekspansi saat ini tidak dioptimalkan untuk diadopsi secara luas. Sampel harus diperlakukan dengan agen penahan khusus untuk menghubungkan biomolekul dan label tertentu ke hidrogel. Selain itu, sebagian besar pendekatan hanya mencapai ekspansi jaringan kira-kira empat kali lipat, membatasi resolusi efektif hingga sekitar 70 nm pada mikroskop optik konvensional dengan lensa objektif terbatas difraksi 280 nm.

Untuk mengatasi kekurangan tersebut, sebuah tim mengepalai di Carnegie Mellon University telah mengembangkan strategi mikroskop ekspansi baru yang disebut Magnify. Protokol, dijelaskan dalam Bioteknologi Alam, menggunakan hidrogel baru yang kokoh secara mekanis yang mempertahankan spektrum biomolekul tanpa memerlukan langkah penahan terpisah.

Magnify dapat memperluas spesimen hingga 11 kali, memungkinkan pencitraan sel dan jaringan dengan resolusi efektif sekitar 25 nm menggunakan mikroskop konvensional. Ketika dikombinasikan dengan pencitraan fluktuasi optik beresolusi tinggi (SOFI, metode pasca-pemrosesan komputasi), ini mencapai resolusi efektif sekitar 15 nm.

Protokol mikroskop ekspansi sebelumnya juga membutuhkan penghapusan banyak biomolekul yang menyatukan jaringan. "Untuk membuat sel benar-benar mengembang, Anda perlu menggunakan enzim untuk mencerna protein, jadi pada akhirnya, Anda memiliki gel kosong dengan label yang menunjukkan lokasi protein yang diinginkan," jelas penulis senior. Yong Xin Zhao dalam pernyataan pers.

“Salah satu nilai jual utama Magnify adalah strategi universal untuk menjaga biomolekul jaringan, termasuk protein, asam nukleat, dan karbohidrat, dalam sampel yang diperluas. Molekul tetap utuh, dan berbagai jenis biomolekul dapat diberi label dalam satu sampel,” tambah Zhao.

Aplikasi luas

Zhao dan rekannya menerapkan Magnify ke berbagai jenis jaringan. Pencitraan bagian otak tikus yang diperluas 11 kali lipat diwarnai untuk kandungan protein total, misalnya, memungkinkan visualisasi arsitektur nanoscopic dari masing-masing sinapsis di otak. Magnify mendemonstrasikan daya penyelesaian efektif sekitar 18 nm menggunakan lensa objektif ×60 (sekitar batas difraksi 200 nm).

Para peneliti mengkonfirmasi distorsi rendah yang diperoleh oleh protokol Magnify pada beberapa jenis jaringan, menggunakan pra-ekspansi SOFI dan pasca-ekspansi confocal microscopy. Mereka tidak menemukan perubahan morfologis substansial antara gambar inti sel dan penanda protein sebelum dan sesudah ekspansi pada tingkat makroskopis atau sub-difraksi.

Tim juga menguji Magnify pada berbagai spesimen tertanam parafin yang difiksasi dengan formalin – yang merupakan salah satu persiapan biopsi terpenting, tetapi sulit untuk diperluas dengan protokol saat ini. Ini termasuk bagian jaringan dari ginjal, payudara, otak dan usus besar, dan tumor yang sesuai. Magnify dapat memperluas sampel dengan faktor sekitar 8.00–10.77 dalam air, tergantung pada jenis jaringan.

Salah satu tujuan utamanya adalah membuat Magnify cocok untuk berbagai spesimen jaringan, memudahkan penyerapannya oleh para peneliti yang ingin mengadopsi protokol baru. “Ini bekerja dengan berbagai jenis jaringan, metode fiksasi, dan bahkan jaringan yang telah diawetkan dan disimpan,” kata rekan penulis pertama Brendan Gallagher. “Ini sangat fleksibel, karena Anda tidak perlu mendesain ulang eksperimen dengan Magnify sepenuhnya; itu akan bekerja dengan apa yang sudah Anda miliki.

Mendongkrak resolusi

Untuk mendemonstrasikan peningkatan lebih lanjut dalam resolusi efektif yang dimungkinkan dengan memasangkan Magnify dengan SOFI, para peneliti menggunakan kombinasi tersebut untuk mencitrakan organoid paru-paru manusia, khususnya silia yang berfungsi untuk membersihkan lendir di saluran napas. Dengan diameter 200 nm dan panjang hanya beberapa mikrometer, struktur ini biasanya terlalu kecil untuk dilihat tanpa menggunakan teknologi seperti mikroskop elektron (EM).

Memperbesar-SOFI dapat sepenuhnya menyelesaikan struktur berongga silia dan badan basal, termasuk cincin luar yang sebelumnya ditunjukkan oleh EM terdiri dari sembilan bundel mikrotubulus. Para peneliti memperkirakan resolusi efektif sekitar 14-17 nm (menggunakan lensa objektif terbatas difraksi 280 nm). Mereka juga mampu memvisualisasikan cacat silia pada sel paru-paru dengan mutasi genetik.

Mikroskop resolusi super mengungkapkan mesin yang mereplikasi virus corona

“Dengan teknik Magnify terbaru, kami dapat memperluas jaringan paru-paru tersebut dan mulai melihat beberapa ultrastruktur silia motil bahkan dengan mikroskop biasa, dan ini akan mempercepat penyelidikan dasar dan klinis,” komentar rekan penulis Xi Ren.

Membangun kesuksesan pengembangan Magnify, tim sekarang menggunakannya untuk mempelajari sampel jaringan yang lebih kompleks. “Ini termasuk mengeksplorasi jaringan yang terinfeksi serta spesimen yang lebih besar seperti seluruh organ,” kata Zhao Dunia Fisika. “Selain itu, kami berupaya mengoptimalkan Magnify untuk menyelidiki sampel patologis manusia dan mempelajari perubahan skala nano di otak selama proses pembelajaran dan penyakit. Dengan terobosan ini, penemuan lebih lanjut dapat diharapkan dari bidang studi yang sangat menjanjikan ini.”

• Konten Bertenaga SEO & Distribusi PR. Dapatkan Amplifikasi Hari Ini.
• Platoblockchain. Intelijen Metaverse Web3. Pengetahuan Diperkuat. Akses Di Sini.
• Sumber: https://physicsworld.com/a/expansion-microscopy-enables-nanoimaging-with-a-conventional-microscope/