La microscopia a fluorescenza di cellule vive fornisce uno strumento indispensabile per studiare la dinamica dei sistemi biologici. Ma molti processi biologici, come la divisione delle cellule batteriche e la divisione mitocondriale, ad esempio, si verificano sporadicamente, rendendoli difficili da catturare.
L'imaging continuo di un campione a un frame rate elevato assicurerebbe che quando si verificano tali divisioni, verranno sicuramente registrate. Ma l'eccesso di immagini a fluorescenza causa il fotosbiancamento e può distruggere prematuramente i campioni viventi. Un frame rate più lento, nel frattempo, rischia di perdere eventi di interesse. Ciò che serve è un modo per prevedere quando sta per accadere un evento e quindi istruire il microscopio per iniziare l'imaging ad alta velocità.
Ricercatori del Politecnico federale di Losanna (EPFL) hanno creato proprio un tale sistema. Il team ha sviluppato un framework di acquisizione guidata da eventi (EDA) che automatizza il controllo del microscopio per visualizzare in dettaglio gli eventi biologici limitando allo stesso tempo lo stress sul campione. Utilizzando le reti neurali per rilevare sottili precursori di eventi di interesse, EDA adatta i parametri di acquisizione, come la velocità di imaging o la durata della misurazione, in risposta.
“Un microscopio intelligente è un po' come un'auto a guida autonoma. Ha bisogno di elaborare determinati tipi di informazioni, modelli sottili a cui poi risponde modificando il suo comportamento", spiega il ricercatore principale Suliana Manley in un comunicato stampa. "Utilizzando una rete neurale, possiamo rilevare eventi molto più sottili e utilizzarli per guidare i cambiamenti nella velocità di acquisizione".
Il framework EDA, descritto in Metodi della natura, consiste in un ciclo di feedback tra un flusso di immagini dal vivo e i controlli del microscopio. I ricercatori hanno utilizzato il software Micro-Manager per acquisire immagini dal microscopio e una rete neurale addestrata su dati etichettati per analizzarli. Per ogni immagine, l'output di rete funge da parametro decisionale per passare dall'imaging lento a quello veloce.
Riconoscimento eventi
Per dimostrare la loro nuova tecnica, Manley e colleghi hanno integrato l'EDA in un microscopio a illuminazione strutturata istantanea e lo hanno utilizzato per catturare filmati time-lapse super risolti delle divisioni mitocondriali e batteriche.
La divisione mitocondriale è imprevedibile, in genere si verifica una volta ogni pochi minuti e dura decine di secondi. Per prevedere l'inizio della divisione, il team ha addestrato la rete neurale a rilevare le costrizioni, un cambiamento nella forma mitocondriale che porta alla divisione, combinato con la presenza di una proteina chiamata DRP1 necessaria per le divisioni spontanee.
La rete neurale emette una mappa termica di "punteggi evento", con valori più alti (quando sia le costrizioni che i livelli DRP1 sono alti) che indicano le posizioni all'interno dell'immagine in cui è più probabile che si verifichi la divisione. Una volta che il punteggio dell'evento supera un valore di soglia, la velocità di imaging aumenta per catturare gli eventi di divisione in dettaglio. Una volta che il punteggio si riduce a una seconda soglia, il microscopio passa all'imaging a bassa velocità per evitare di esporre il campione a luce eccessiva.
I ricercatori hanno eseguito l'EDA su cellule che esprimono etichette fluorescenti mirate ai mitocondri. Durante ogni misurazione EDA, la rete ha riconosciuto i precursori della divisione batterica in media nove volte. Ciò ha commutato la velocità di imaging da lenta (0.2 fotogrammi/s) a veloce (3.8 fotogrammi/s) per una media di 10 s, ottenendo immagini veloci per il 18% dei fotogrammi. Notano che molti siti hanno accumulato DRP1 ma non hanno portato alla divisione. Questi siti non hanno attivato la rete, dimostrando la sua capacità di discriminare gli eventi di interesse.
Per fare un confronto, il team ha anche raccolto immagini a velocità costanti lente e veloci. L'EDA ha causato meno fotosbiancamento del campione rispetto all'imaging veloce a velocità fissa, consentendo osservazioni più lunghe di ciascun campione e aumentando le probabilità di catturare rari eventi di divisione mitocondriale. In alcuni casi, il campione si è ripreso dal fotosbiancamento durante le lente fasi di imaging, consentendo una dose di luce cumulativa più elevata.
Sebbene lo sbiancamento fosse più elevato con EDA rispetto all'imaging lento costante, molte sessioni EDA hanno raggiunto i 10 minuti senza degradazione della salute del campione. I ricercatori hanno anche scoperto che l'EDA ha risolto meglio le costrizioni che precedono la divisione, così come la progressione degli stati della membrana che portano alla fissione, come catturato dalle raffiche di immagini veloci.
"Il potenziale della microscopia intelligente include la misurazione di ciò che le acquisizioni standard mancherebbero", spiega Manley. "Catturiamo più eventi, misuriamo costrizioni più piccole e possiamo seguire ogni divisione in modo più dettagliato".
Rilevamento della divisione batterica
Successivamente, i ricercatori hanno utilizzato l'EDA per studiare la divisione cellulare nei batteri C. crescentus. Il ciclo cellulare batterico si verifica su una scala temporale di decine di minuti, creando sfide distinte per la microscopia di cellule vive. Hanno raccolto dati a una bassa velocità di imaging di 6.7 fotogrammi/ora, a una velocità di imaging elevata di 20 fotogrammi/ora oa una velocità variabile commutata da EDA.
Il team ha scoperto che la rete di rilevamento degli eventi sviluppata per le costrizioni mitocondriali potrebbe riconoscere le fasi finali della divisione batterica senza ulteriore addestramento, probabilmente a causa delle somiglianze nella forma della costrizione e della presenza di un marcatore molecolare funzionalmente simile.
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Ancora una volta, l'EDA ha ridotto il fotosbiancamento rispetto all'imaging veloce costante e ha misurato le costrizioni con diametri medi significativamente più piccoli rispetto all'imaging lento costante. L'EDA ha consentito l'imaging dell'intero ciclo cellulare e ha fornito dettagli sulla divisione delle cellule batteriche difficili da acquisire utilizzando una velocità di imaging fissa.
Racconta Manley Mondo della fisica che il team prevede anche di addestrare reti neurali per rilevare diversi tipi di eventi e utilizzarli per evocare diverse risposte hardware. "Ad esempio, prevediamo di sfruttare le perturbazioni optogenetiche per modulare la trascrizione nei momenti chiave della differenziazione cellulare", spiega. "Pensiamo anche di utilizzare il rilevamento degli eventi come mezzo di compressione dei dati, selezionando per l'archiviazione o l'analisi i pezzi di dati più rilevanti per un determinato studio".
- Per consentire ai ricercatori di implementare l'EDA su un'ampia varietà di microscopi, il team sta fornendo il quadro di controllo come un plug-in open source per il software Micro-Manager.
