RALEIGH – Noem het een CRISPR-raadsel.
Bacteriën gebruiken CRISPR-Cas-systemen als adaptief immuunsysteem om aanvallen van vijanden zoals virussen te weerstaan. Deze systemen zijn door wetenschappers aangepast om specifieke genetische codesequenties in een verscheidenheid aan organismen te verwijderen of te knippen en te vervangen.
[CRISPR Cas is een adaptief immuunsysteem dat in de meeste bacteriën en archaea voorkomt en voorkomt dat ze worden geïnfecteerd door fagen, virussen en andere vreemde genetische elementen, aldus het National Institute of Health.]
Rodolphe Barrangou (NCSU-foto)
Maar in een nieuwe studie laten onderzoekers van de North Carolina State University zien dat virussen die zijn ontwikkeld met een CRISPR-Cas-systeem de bacteriële afweer kunnen dwarsbomen en selectieve veranderingen kunnen aanbrengen in een gerichte bacterie – zelfs als andere bacteriën zich in de buurt bevinden.
“Virussen zijn erg goed in het leveren van ladingen. Hier gebruiken we een bacterieel virus, een bacteriofaag, om CRISPR aan bacteriën af te geven, wat ironisch is omdat bacteriën CRISPR normaal gesproken gebruiken om virussen te doden”, aldus Rodolphe Barrangou, de Todd R. Klaenhammer Distinguished Professor of Food, Bioprocessing and Nutrition Sciences bij NC State en corresponderend auteur van een artikel waarin het onderzoek wordt beschreven dat vandaag is gepubliceerd in Proceedings van de National Academy of Sciences. “Het virus is in dit geval het doelwit E. coli door er DNA aan af te leveren. Het is alsof je een virus als spuit gebruikt.”
De onderzoekers van NC State hebben twee verschillende bacteriofagen ingezet om CRISPR-Cas-payloads te leveren voor het gericht bewerken van E. coli, eerst in een reageerbuis en vervolgens in een synthetische bodemomgeving die is gecreëerd om de bodem na te bootsen – een complexe omgeving die vele soorten bacteriën kan herbergen.
Beide gemanipuleerde bacteriofagen, genaamd T7 en lambda, hebben met succes ladingen gevonden en vervolgens afgeleverd aan de E. coli gastheer op de laboratoriumbank. Deze ladingen brachten bacteriële fluorescerende genen tot expressie en manipuleerden de resistentie van de bacterie tegen een antibioticum.
De onderzoekers gebruikten vervolgens lambda om een zogenaamde cytosinebase-editor aan de computer te leveren E. coli gastheer. In plaats van de soms harde splitsing van DNA-sequenties door CRISPR, veranderde deze basiseditor slechts één letter van E coli's DNA, dat de gevoeligheid en precisie van het systeem laat zien. Deze veranderingen hebben bepaalde bacteriële genen geïnactiveerd zonder andere wijzigingen aan te brengen E. coli.
“We gebruikten hier een basiseditor als een soort programmeerbare aan-uitschakelaar voor genen in E. coli. Met behulp van een systeem als dit kunnen we zeer nauwkeurige wijzigingen van één letter in het genoom aanbrengen zonder de dubbelstrengige DNA-breuk die gewoonlijk wordt geassocieerd met CRISPR-Cas-targeting”, zegt Matthew Nethery, voormalig NC State Ph.D. student en hoofdauteur van het onderzoek.
Ten slotte demonstreerden de onderzoekers bewerking ter plaatse door het gebruik van een gefabriceerd ecosysteem (EcoFAB) geladen met een synthetisch bodemmedium van zand en kwarts, samen met vloeistof, om een bodemomgeving na te bootsen. De onderzoekers voegden ook drie verschillende soorten bacteriën toe om te testen of de faag specifiek kon lokaliseren E. coli binnen het systeem.
“In een laboratorium kunnen wetenschappers dingen te simpel maken,” zei Barrangou. “Het verdient de voorkeur om omgevingen te modelleren, dus in plaats van soep in een reageerbuis wilden we echte omgevingen onderzoeken.”
De onderzoekers voegden lambda toe aan het verzonnen ecosysteem. Het toonde een goede efficiëntie bij het vinden E. coli en het aanbrengen van de gerichte genetische veranderingen.
"Deze technologie zal ons team en anderen in staat stellen de genetische basis te ontdekken van belangrijke bacteriële interacties met planten en andere microben in sterk gecontroleerde laboratoriumomgevingen zoals EcoFAB's", zegt Trent Northen, een wetenschapper bij het Lawrence Berkeley National Laboratory van het Department of Energy. (Berkeley Lab) die samenwerkt met Barrangou.
“Wij zien dit als een mechanisme om het microbioom te helpen. We kunnen een bepaalde bacterie veranderen en de rest van het microbioom blijft ongedeerd”, zegt Barrangou. “Dit is een proof of concept dat in elke complexe microbiële gemeenschap zou kunnen worden toegepast, wat zich zou kunnen vertalen in een betere plantgezondheid en een betere gezondheid van het maagdarmkanaal – omgevingen die van belang zijn voor voedsel en gezondheid.
“Uiteindelijk vertegenwoordigt deze studie het volgende hoofdstuk van CRISPR-levering – het gebruik van virussen om CRISPR-machines in een complexe omgeving te leveren.”
De onderzoekers zijn van plan dit werk voort te zetten door de faag CRISPR-techniek te testen met andere bodemgerelateerde bacteriën. Belangrijk is dat dit illustreert hoe microbiële gemeenschappen in de bodem kunnen worden gemanipuleerd om de samenstelling en functie van bacteriën geassocieerd met planten in gefabriceerde ecosystemen te controleren om te begrijpen hoe de plantengroei kan worden verbeterd en de gezondheid van planten kan worden bevorderd, wat van breed belang is voor duurzame landbouw.
De financiering werd verstrekt door m-CAFE's Mbiotic Community Analysis & Functional Evaluation in Soils, een wetenschapsfocusgebied onder leiding van Lawrence Berkeley National Laboratory en ondersteund door het Amerikaanse ministerie van Energie onder contractnr. DE-AC02-05CH11231, met gezamenlijke inspanningen, waaronder UC Berkeley en het Innovative Genomics Institute. Co-auteurs van het artikel zijn onder meer Nethery, voormalig postdoctoraal onderzoeker Claudio Hidalgo-Cantabrana van NC State en Avery Roberts, afgestudeerd aan NC State.
(C) NCSU
