RALEIGH – Kall det en CRISPR-gåte.
Bakterier bruker CRISPR-Cas-systemer som adaptive immunsystemer for å motstå angrep fra fiender som virus. Disse systemene har blitt tilpasset av forskere for å fjerne eller kutte og erstatte spesifikke genetiske kodesekvenser i en rekke organismer.
[CRISPR-Cas er et adaptivt immunsystem som finnes i de fleste bakterier og archaea, og hindrer dem fra å bli infisert av fager, virus og andre fremmede genetiske elementer, ifølge National Institute of Health.]
Rodolphe Barrangou (NCSU-bilde)
Men i en ny studie viser forskere fra North Carolina State University at virus konstruert med et CRISPR-Cas-system kan hindre bakterieforsvar og gjøre selektive endringer på en målrettet bakterie – selv når andre bakterier er i nærheten.
"Virus er veldig flinke til å levere nyttelast. Her bruker vi et bakterievirus, en bakteriofag, for å levere CRISPR til bakterier, noe som er ironisk fordi bakterier normalt bruker CRISPR for å drepe virus, sa Rodolphe Barrangou, Todd R. Klaenhammer utmerkede professor i mat, bioprosessering og ernæringsvitenskap ved NC State og tilsvarende forfatter av en artikkel som beskriver forskningen publisert i dag i Proceedings of National Academy of Sciences. "Viruset i dette tilfellet er målrettet E. coli ved å levere DNA til den. Det er som å bruke et virus som en sprøyte.»
NC State-forskerne distribuerte to forskjellige konstruerte bakteriofager for å levere CRISPR-Cas-nyttelast for målrettet redigering av E. coli, først i et reagensrør og deretter i et syntetisk jordmiljø laget for å etterligne jord – et komplekst miljø som kan huse mange typer bakterier.
Begge de konstruerte bakteriofagene, kalt T7 og lambda, ble funnet og leverte nyttelast til E. coli vert på laboratoriebenken. Disse nyttelastene uttrykte bakterielle florescerende gener og manipulerte bakteriens motstand mot et antibiotikum.
Forskerne brukte deretter lambda for å levere en såkalt cytosinbase-editor til E. coli vert. I stedet for CRISPRs noen ganger tøffe spalting av DNA-sekvenser, endret denne baseeditoren bare én bokstav i E coli's DNA, som viser systemets følsomhet og presisjon. Disse endringene inaktiverte visse bakteriegener uten å gjøre andre endringer på E. coli.
"Vi brukte en baseeditor her som en slags programmerbar av/på-bryter for gener i E. coli. Ved å bruke et system som dette kan vi gjøre svært nøyaktige enkeltbokstavsendringer i genomet uten dobbelttråds-DNA-brudd som vanligvis er forbundet med CRISPR-Cas-målretting, sier Matthew Nethery, en tidligere NC State Ph.D. student og hovedforfatter av studien.
Til slutt demonstrerte forskerne redigering på stedet gjennom bruk av et fabrikkert økosystem (EcoFAB) lastet med et syntetisk jordmedium av sand og kvarts, sammen med væske, for å etterligne et jordmiljø. Forskerne inkluderte også tre forskjellige typer bakterier for å teste om fagen spesifikt kunne lokalisere E. coli innenfor systemet.
"I et laboratorium kan forskere forenkle ting," sa Barrangou. "Det er å foretrekke å modellere miljøer, så i stedet for suppe i et reagensrør, ønsket vi å undersøke virkelige miljøer."
Forskerne satte inn lambda i det fabrikkerte økosystemet. Det viste god effektivitet i å finne E. coli og gjøre de målrettede genetiske endringene.
"Denne teknologien vil gjøre vårt team og andre i stand til å oppdage det genetiske grunnlaget for viktige bakterielle interaksjoner med planter og andre mikrober i svært kontrollerte laboratoriemiljøer som EcoFABs," sa Trent Northen, en forsker ved Department of Energy's Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) som samarbeider med Barrangou.
"Vi ser på dette som en mekanisme for å hjelpe mikrobiomet. Vi kan gjøre en endring på en bestemt bakterie og resten av mikrobiomet forblir uskadd, sa Barrangou. "Dette er et proof of concept som kan brukes i ethvert komplekst mikrobielt samfunn, som kan oversettes til bedre plantehelse og bedre mage-tarmkanalhelse - miljøer av betydning for mat og helse.
"Til syvende og sist representerer denne studien neste kapittel av CRISPR-levering – bruk av virus for å levere CRISPR-maskineri i et komplekst miljø."
Forskerne planlegger å fremme dette arbeidet ved å teste fag CRISPR-teknikken med andre jord-assosierte bakterier. Viktigere, dette illustrerer hvordan jordmikrobielle samfunn kan manipuleres for å kontrollere sammensetningen og funksjonen til bakterier assosiert med planter i fabrikkerte økosystemer for å forstå hvordan man kan forbedre plantevekst og fremme plantehelse, som er av bred interesse for bærekraftig landbruk.
Finansiering ble gitt av m-CAFEs Microbial Community Analysis & Functional Evaluation in Soils, et vitenskapelig fokusområde ledet av Lawrence Berkeley National Laboratory og støttet av US Dept. of Energy under kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231, med samarbeidsarbeid inkludert UC Berkeley og Innovative Genomics Institute. Medforfattere av artikkelen inkluderer Nethery, tidligere NC State post-doktorgradsforsker Claudio Hidalgo-Cantabrana og NC State graduate student Avery Roberts.
(C) NCSU
