A microscopia de fluorescência de células vivas fornece uma ferramenta indispensável para estudar a dinâmica de sistemas biológicos. Mas muitos processos biológicos – como a divisão celular bacteriana e a divisão mitocondrial, por exemplo – ocorrem esporadicamente, tornando-os difíceis de capturar.
A geração contínua de imagens de uma amostra em uma alta taxa de quadros garantiria que, quando tais divisões ocorressem, elas seriam definitivamente registradas. Mas imagens de fluorescência excessivas causam fotodegradação e podem destruir prematuramente amostras vivas. Enquanto isso, uma taxa de quadros mais lenta corre o risco de perder eventos de interesse. O que é necessário é uma maneira de prever quando um evento está prestes a acontecer e então instruir o microscópio para iniciar a geração de imagens em alta velocidade.
Pesquisadores do Instituto Federal Suíço de Tecnologia de Lausanne (EPFL) criaram exatamente esse sistema. A equipe desenvolveu uma estrutura de aquisição orientada a eventos (EDA) que automatiza o controle do microscópio para gerar imagens detalhadas de eventos biológicos, ao mesmo tempo que limita o estresse na amostra. Usando redes neurais para detectar precursores sutis de eventos de interesse, o EDA adapta os parâmetros de aquisição – como velocidade de imagem ou duração da medição – em resposta.
“Um microscópio inteligente é como um carro autônomo. Precisa de processar certos tipos de informação, padrões subtis aos quais responde alterando o seu comportamento”, explica o investigador principal. Suliana Manley em um comunicado à imprensa. “Ao usar uma rede neural, podemos detectar eventos muito mais sutis e usá-los para gerar mudanças na velocidade de aquisição.”
A estrutura da EDA, descrita em Nature Methods, consiste em um ciclo de feedback entre um fluxo de imagem ao vivo e os controles do microscópio. Os pesquisadores usaram o software Micro-Manager para capturar imagens do microscópio e uma rede neural treinada em dados rotulados para analisá-los. Para cada imagem, a saída da rede atua como um parâmetro de tomada de decisão para alternar entre imagens lentas e rápidas.
Reconhecimento de eventos
Para demonstrar sua nova técnica, Manley e colegas integraram o EDA em um microscópio de iluminação estruturada instantânea e o usaram para capturar filmes de lapso de tempo super-resolvidos de divisões mitocondriais e bacterianas.
A divisão mitocondrial é imprevisível, normalmente ocorrendo uma vez a cada poucos minutos e durando dezenas de segundos. Para prever o início da divisão, a equipe treinou a rede neural para detectar constrições, uma mudança na forma mitocondrial que leva à divisão, combinada com a presença de uma proteína chamada DRP1, necessária para divisões espontâneas.
A rede neural gera um mapa de calor de “pontuações de eventos”, com valores mais altos (quando as constrições e os níveis de DRP1 são altos) indicando locais dentro da imagem onde a divisão tem maior probabilidade de ocorrer. Quando a pontuação do evento excede um valor limite, a velocidade da imagem aumenta para capturar os eventos de divisão em detalhes. Uma vez que a pontuação reduz para um segundo limite, o microscópio muda para imagens de baixa velocidade para evitar a exposição da amostra à luz excessiva.
Os pesquisadores realizaram EDA em células que expressam rótulos fluorescentes direcionados às mitocôndrias. Durante cada medição de EDA, a rede reconheceu precursores da divisão bacteriana nove vezes, em média. Isso alternou a velocidade da imagem de lenta (0.2 quadros/s) para rápida (3.8 quadros/s) por uma média de 10 s, resultando em imagens rápidas para 18% dos quadros. Eles observam que muitos sites acumularam DRP1, mas não levaram à divisão. Esses sites não acionaram a rede, demonstrando sua capacidade de discriminar eventos de interesse.
Para efeito de comparação, a equipe também coletou imagens em velocidades lentas e rápidas constantes. A EDA causou menos fotodegradação da amostra do que a imagem rápida de taxa fixa, permitindo observações mais longas de cada amostra e aumentando as chances de capturar eventos raros de divisão mitocondrial. Em alguns casos, a amostra recuperou-se do fotobranqueamento durante as fases lentas de imagem, permitindo uma dose cumulativa de luz mais elevada.
Embora o branqueamento tenha sido maior com EDA do que com imagens lentas constantes, muitas sessões de EDA atingiram 10 minutos sem degradação da saúde da amostra. Os investigadores também descobriram que a EDA resolveu melhor as constrições que precedem a divisão, bem como a progressão dos estados da membrana que conduzem à fissão, conforme capturado pelas explosões de imagens rápidas.
“O potencial da microscopia inteligente inclui medir o que as aquisições padrão perderiam”, explica Manley. “Capturamos mais eventos, medimos constrições menores e podemos acompanhar cada divisão com mais detalhes.”
Detectando divisão bacteriana
Em seguida, os pesquisadores usaram o EDA para estudar a divisão celular nas bactérias C. crescente. O ciclo celular bacteriano ocorre na escala de tempo de dezenas de minutos, criando desafios distintos para a microscopia de células vivas. Eles coletaram dados a uma velocidade lenta de imagem de 6.7 quadros/hora, uma velocidade rápida de imagem de 20 quadros/hora ou uma velocidade variável alternada por EDA.
A equipe descobriu que a rede de detecção de eventos desenvolvida para constrições mitocondriais poderia reconhecer os estágios finais da divisão bacteriana sem treinamento adicional – provavelmente devido às semelhanças na forma da constrição e à presença de um marcador molecular funcionalmente semelhante.
Técnica aprimorada de microscopia vê células vivas com sete vezes mais sensibilidade
Novamente, o EDA reduziu o fotobranqueamento em comparação com imagens rápidas constantes e mediu constrições com diâmetros médios significativamente menores do que com imagens lentas constantes. A EDA permitiu imagens de todo o ciclo celular e forneceu detalhes da divisão celular bacteriana que são difíceis de capturar usando uma velocidade de imagem fixa.
Manley conta Mundo da física que a equipe também planeja treinar redes neurais para detectar diferentes tipos de eventos e usá-los para evocar diferentes respostas de hardware. “Por exemplo, pretendemos aproveitar perturbações optogenéticas para modular a transcrição em momentos-chave da diferenciação celular”, explica ela. “Também pensamos em usar a detecção de eventos como meio de compressão de dados, selecionando para armazenamento ou análise os dados mais relevantes para um determinado estudo.”
- Para permitir que os pesquisadores implementem o EDA em uma ampla variedade de microscópios, a equipe está fornecendo a estrutura de controle como um plug-in de código aberto para o software Micro-Manager.
