Заявление о миссии на домашней странице лаборатории Стэнфордского университета Серджиу Пашка одновременно прост и поразительно амбициозен. Его группа «стремится понять правила, управляющие молекулярными и клеточными этапами, лежащими в основе сборки нервной системы человека, и молекулярные механизмы, которые приводят к неврологическим и психическим заболеваниям».
Путь, выбранный Пашкой для достижения этой цели, использует передовую форму технологии стволовых клеток. Во-первых, он генетически перепрограммирует клетки кожи аутичных людей и пациентов с такими расстройствами, как шизофрения, в универсальные стволовые клетки; затем он заставляет клетки перейти в более определенное состояние, как нервная ткань в лабораторной чашке. Наблюдая за тем, как эти клетки функционируют или неправильно функционируют, Пашка, профессор психиатрии и поведенческих наук в Стэнфорде и директор Института неврологии Ву Цай, получает представление о том, что отличает мозг людей с неврологическими заболеваниями.
Стремясь сделать эти модельные системы более реалистичными, он сделал, казалось бы, фантастические научные инновации. В своей лаборатории в Пало-Альто Пашка создал миниатюрные сферические ткани или органоиды, которые напоминают различные области человеческого мозга. Он и его коллеги соединили органоиды головного, спинного мозга и мышечной ткани в «ассемблоиды», которые могут дергаться по команде.
И в новая работа Группа Пашки, только что анонсированная сегодня, показала, что человеческие органоиды, введенные в развивающийся мозг молодой крысы, могут спонтанно распространяться и интегрироваться в нейронную сеть животного — результат, указывающий путь к исследовательским моделям человеческого мозга, которые становятся все более совершенными. реалистичный, но практичный и этичный для работы.
Когда Фонд Вилчека из Нью-Йорка присудил Пашке премию 2018 года за творческое обещание в области биомедицинских наук, они сделали это, потому что его «усилия привели к созданию хранилища культур мозга, полученных от пациентов, которые являются одними из самых реалистичных макетов развития мозга, доступных сегодня исследователям. ».
По словам его научного руководителя, Рикардо Дольметч, президент отдела исследований и разработок в компании генной терапии uniQure: «Работа Серджиу повышает вероятность того, что однажды мы сможем трансплантировать отсутствующие клетки мозга людям с заболеваниями или разработать лабораторные модели неврологических или психических заболеваний, которые мы сможем использовать для разрабатывать лекарства».
Прошлым летом мы разговаривали с Пашкой через Zoom и по телефону. Интервью были сжаты и отредактированы для ясности.
Вы всегда хотели заниматься научными исследованиями?
С раннего возраста. Да.
Я вырос в Румынии, в маленьком городке в Трансильвании. В детстве я построил лабораторию в подвале дома моей семьи. Я бы попытался улучшить рост растений, добавляя в почву различные химические вещества, а затем измеряя их эффект. Однажды я добавил молекулу на основе меди. Это заставило одно из моих растений увеличиться на 20%. Это зацепило меня в исследованиях.
А сегодня вы выращиваете нервные клетки в лаборатории. Как это произошло?
[Смеётся.] Это долгая история. Я учился в школе после свержения диктатуры Чаушеску. В то время Румыния страдала от долгосрочных последствий диктатуры — изоляции, отсталости. По окончании средней школы я выиграл приз на национальном конкурсе по химии. Приз давался при поступлении в любой румынский университет. Я выбрал Медицинский университет Юлиу Хациегану в Клуж-Напоке. Идея заключалась в том, чтобы стать врачом-исследователем. Я думал тогда и чувствую до сих пор, что миру нужно их больше.
К сожалению, попав в медучилище, я обнаружил, что ресурсов мало: ни грантов, ни реагентов для лабораторных работ. Но у меня был один очень преданный своему делу профессор, и она потратила 200 евро из собственных денег — целое состояние по тем временам — чтобы заказать в Германии небольшой набор реагентов. Затем мы целый год планировали, как лучше всего его использовать.
Вот так у меня впервые появилось изучение заболеваний головного мозга. Я подумывал использовать этот набор реагентов для проверки метаболитов в крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Но чтобы что-то узнать, мне нужно протестировать сотни, а то и тысячи пациентов. Реагентов нам хватило только на 50 реакций!
Однажды на уроке статистики меня осенило: единственный способ провести исследование с небольшой группой пациентов — это изучить редкое заболевание. Я подумал: аутизм.
Аутизм? Это не так уж и редко — в той или иной форме есть у одного из 50.
Мы не знали этого 20 лет назад.
Моя идея заключалась в том, чтобы посмотреть, сможем ли мы найти признаки этого состояния в крови детей с аутизмом. Для проведения исследования мне нужно было убедить родителей сдавать небольшое количество крови своих детей. Разговаривать с ними было душераздирающе. Это открыло мне глаза на огромные страдания, через которые прошли семьи. Родители недоумевали: «Что стало причиной этого?»
Все, что я мог сказать, было: «Ничего не известно».
Чтобы лучше отвечать на вопросы, я записался на курс в Бухаресте, организованный Международной организацией по исследованию мозга, IBRO. Это были американские и британские нейробиологи, пытавшиеся внедрить передовую науку о мозге в изолированные страны. Ясность их презентаций и красота нейробиологических открытий, которые они описали, чрезвычайно взволновали меня.
На занятиях я познакомился с Джеком МакМаханом, одним из основателей программы нейробиологии в Стэнфорде. Мы поддерживали связь, и позже он помог мне приехать в Калифорнию.
Что стало с вашим исследованием метаболитов?
Мы обнаружили, что у некоторых пациентов с аутизмом были нарушения одноуглеродного метаболизма. Этот путь, который зависит от фолиевой кислоты и витаминов группы В, был слегка нарушен, и это, вероятно, было связано с комбинацией генетических и пищевых факторов.
К тому времени, когда я закончил медицинскую школу, я опубликовал несколько статей по аутизму. Джек МакМахан прочитал их и сказал: «Почему бы тебе не поступить в Стэнфорд? У меня есть коллега, заинтересованный в продвижении своей лаборатории в этом направлении». Это был Рикардо Дольметч, который через несколько лет стал главой отдела неврологии в Институте биомедицинских исследований Novartis.
Потребовалось некоторое время, чтобы получить финансирование, но в конце концов я получил стипендию IBRO и приехал в Пало-Альто.
Каково было ваше задание в лаборатории Дольметша?
Создать новый подход к изучению человеческого мозга.
За пару лет до этого Шинья Яманака из Калифорнийского университета в Сан-Франциско и Киотского университета придумал, как взять клетки кожи мышей и перепрограммировать их, чтобы они снова превратились в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки — iPS-клетки. Стволовые клетки можно превратить во все виды различных клеток, включая нейроны, строительные блоки нервной системы. Яманака получит за это Нобелевскую премию.
В лаборатории Рикардо я планировал найти способы превратить iPS-клетки человека в нейроны. Идея заключалась в том, чтобы получить клетки кожи детей с аутизмом, превратить их обратно в стволовые клетки, а затем направить их в нейроны в чашке Петри. Если бы нам это удалось, мы надеялись преодолеть барьеры, которые мешали нам полностью понять, как развивается нервная система человека. Это позволит с большей ясностью понять биологическую основу нейропсихиатрических состояний, таких как аутизм, эпилепсия и шизофрения.
Что это за барьеры?
Главная проблема — невыносимая неприступность человеческого мозга.
Когда что-то идет не так в селезенке или печени, врачи берут биопсию и анализируют ткань. Эта практика произвела революцию в медицине. Исследователи смогли взять клетки пациентов, поместить их в чашку, определить механизмы сбоя и применить различные соединения для их восстановления. Вот как они открыли новые наркотики.
Но, за исключением редких случаев, мы не просверливаем череп живого человека для непосредственного изучения тканей человеческого мозга. Помимо медицинских рисков, существуют глубокие культурные табу. Мы склонны ассоциировать мозг с «нами», с тем, кто мы есть. Воздействуя непосредственно на мозг, эти методы в некотором роде рассматриваются как вмешательство в «я».
Вспоминая свои клинические ротации в медицинском институте, я почти завидовал своим коллегам из онкологического отделения. Революция в области молекулярной биологии в сочетании с доступностью интересующих их раковых тканей означала, что у них в разработке были новые методы лечения. Например, удивительные вещи происходили с лейкемией.
С аутизмом у нас ничего не было. Мы не могли определить механизмы, вызвавшие проблемы, потому что не могли напрямую изучать мозговую ткань. И даже если бы мы могли, мы бы не знали, что искать.
Не могли бы вы изучить ткань человеческого мозга, полученную при вскрытии?
Посмертный мозг мало что говорит вам об электрической активности живых нейронов. Вам нужно измерить эту активность, потому что это то, что делают нейроны в мозгу: они запускают электрические сигналы.
Что касается животных моделей, то они имеют ограничения, когда речь идет об исследованиях психических расстройств. Человеческий мозг устроен сложнее, чем у мышей или даже макак. Миллионы лет эволюции отделяют нас от этих животных. Мы видели бесчисленное множество примеров лекарств, которые были весьма успешными на грызунах, а затем потерпели неудачу в клинических испытаниях на людях.
Я подумал, что мы могли бы продвинуться вперед, создав живую ткань человеческого мозга самостоятельно.
Ваша идея, должно быть, вызвала споры.
О, да. Были люди, которые думали, что это не сработает. Они думали, что при трансформации клеток кожи вы потеряете патофизиологию болезни, и тогда мы не сможем открыть ничего нового.
Тем не менее в течение восьми месяцев у нас были функционирующие человеческие нейроны из стволовых клеток, которые начинались как кожа пациентов с генетической формой аутизма. Глядя на них под микроскопом, можно было увидеть, как они излучают кальциевые сигналы. Мы куда-то шли.
Как можно сделать нейроны?
Клеточное перепрограммирование дало нам стволовые клетки из клеток кожи. Затем мы заставили стволовые клетки дифференцироваться в другие типы клеток.
Стволовые клетки любят дифференцироваться. Они должны превратиться в другие типы клеток. И они на самом деле имеют высокую вероятность стать нейронами практически по умолчанию. Вам не нужно делать так много, чтобы создать нейроны, хотя управление ими помогает. Что вы делаете, так это добавляете в среду, в которой хранятся стволовые клетки, молекулы, способствующие трансформации. Иногда вы также убираете некоторые молекулы.
Вскоре у нас появились миллионы красивых нейронов. Плохая новость заключалась в том, что наши нейроны прилипли ко дну чашки Петри в один слой клеток, где после нескольких недель культивирования они вышли из строя. Если бы мы хотели выяснить, что происходит с человеческим мозгом по мере его развития в течение месяцев за месяцами, нам нужны были бы нейроны с более длительным существованием.
У меня была идея. Я купил набор пластиковых лабораторных чашек, покрытых антипригарным веществом, и мы выращивали в них клетки. Удивительно, но гамбит сработал! Клетки не могли прилипнуть к чашке. Вместо этого они плавали в среде, поддерживая их, и собирались в маленькие шарики размером с горошину.
Сначала мы назвали эти плавающие скопления клеток сфероидами. Позже их стали называть органоидами — чем-то, что напоминало определенный орган, но им не было.
Чем клетки в этих шариках отличались от ваших одиноких нейронов?
Они росли в трехмерном пространстве. Они двигались и взаимодействовали друг с другом. Важно отметить, что их можно было хранить в тарелке в течение более длительного периода времени.
При правильных обстоятельствах мы могли бы хранить органоиды 900 дней. И это позволило нам наблюдать новые вещи. Например, в возрасте девяти или десяти месяцев клетки стали больше похожи на постнатальные нейроны, чем на пренатальные. Казалось, они чувствовали течение времени и то, что это должно означать для их развития.
Насколько полезными были органоиды для вашего исследования?
Позвольте мне рассказать вам об эксперименте, который мы провели с ними.
Существует генетическое заболевание, называемое синдромом делеции 22q11.2, при котором происходит потеря части 22-й хромосомы. У больных в 30 раз повышен риск шизофрении. У них также может развиться аутизм или другие нервно-психические расстройства. Мы набрали 15 пациентов и 15 здоровых людей и начали создавать нейроны, напоминающие кору головного мозга, из пожертвованной ими кожи. Мы видели, что нейроны пациентов имели аномальные электрические свойства. Они не могли нормально общаться друг с другом.
Сейчас шизофрению часто лечат нейролептиками. Мы поместили некоторые из этих препаратов в чашку с кортикальными органоидами, сделанными из клеток наших пациентов, и увидели, что антипсихотические препараты решили проблему с электрическими свойствами нейронов.
Это означало, что теперь у нас был способ проверить эти лекарства в чашке.
Вы говорили об органоидах. Но что такое ассемблоиды?
Ассемблоиды — это новая модельная система, которую мы придумали шесть-семь лет назад. Это трехмерные системы клеточных культур, построенные как минимум из двух различных типов органоидов или путем объединения органоидов с некоторыми другими специализированными типами клеток. Соединяя их вместе, мы можем увидеть новые свойства клеток, возникающие в результате их тесного взаимодействия.
Вы можете соединить два органоида, напоминающих разные области мозга, и посмотреть, как нейроны проецируются друг на друга, а затем соединяются, образуя цепи. Или вы можете объединить органоиды с иммунными клетками и посмотреть на нейроиммунные взаимодействия при заболеваниях.
Например, существует редкий тип аутизма, связанный с генетическим заболеванием, который называется синдромом Тимоти. Это вызвано однобуквенной мутацией в гене, кодирующем кальциевый канал. Это позволяет слишком большому количеству кальция проникать в клетки, когда они получают электрические сигналы. Это мешает передаче химических сигналов в нейронах и других возбудимых клетках.
Мы взяли клетки кожи пациентов с синдромом Тимоти, сделали ассамблоиды и затем наблюдали, что в них происходит. Мы могли видеть, что нейроны, выращенные из клеток пациентов, двигались чаще, но на более короткие расстояния, чем нейроны из контрольной группы здоровых людей. Клетки пациентов в конечном итоге отстали в своей организации.
Должно быть, было захватывающе наблюдать за этим в режиме реального времени.
Вы могли видеть это! Вы буквально видели это своими глазами!
У нас был такой краситель, который окрашивал кальций. В тот момент, когда кальций попадал в клетки, вы могли видеть, как цвета менялись вверх и вниз, показывая, сколько кальция попало внутрь клетки. В камерах больных его было больше.
Мы потратили шесть лет на выяснение того, как именно этот кальциевый канал вызывает дефекты в движении этих специфических типов нейронов. Мутированный канал у пациентов влияет на два разных молекулярных пути в нейронах. Важно отметить, что мы обнаружили, что для восстановления активности нужны два разных препарата. Мы думаем, что теперь у нас есть основа для того, что в будущем может привести нас к лечению.
Мы бы никогда не смогли узнать это без ассемблоидов, потому что вам нужно, чтобы клетки взаимодействовали в трех измерениях, чтобы зафиксировать это.
В своей новой статье вы сообщаете, что в вашей лаборатории создана крыса, у которой человеческие нейроны покрывают треть коры головного мозга животного в одном полушарии и глубоко интегрируются в мозг. Зачем создавать эту модель?
Уже более десяти лет мы готовим культуры в блюде, которые воспроизводят многие аспекты нервной системы человека. Но у этих культур есть ограничения: нейроны, которые мы создали, не вырастают до таких больших размеров. Нет никаких поведенческих результатов, как в реальном человеческом мозгу. И они не получают сенсорной информации, которая определяла бы их развитие — кора должна получать сигналы. Мы пытались обеспечить какой-то значимый внешний ввод для этих человеческих нейронов.
Поэтому следующим шагом было выращивание человеческих нейронов внутри мозга крысы. Мы взяли органоиды и пересадили их в кору головного мозга крысят. Органоид васкуляризировался крысой и в конечном итоге разросся, чтобы покрыть одну треть ее полушария коры головного мозга.
Я думал, вы не очень любите животных моделей для исследования человеческого мозга. Что случилось?
Я думаю, что модели животных и клеточные модели человека дополняют друг друга. В этом случае трансплантация животным позволяет интегрировать нейроны человека в цепи для понимания этих болезней и тестирования лекарств. Это еще один способ понять, как нейроны человека обрабатывают информацию в живых цепях.
Таким образом, эти человеческие нейроны из органоидов имели возможность вырасти в мозге крысы, и они смогли получать входные и выходные данные от животного. Как они соотносятся с нейронами, которые выросли только внутри органоидов? И как они соотносятся с нейронами, растущими в нашем собственном мозгу?
Трансплантированные человеческие нейроны примерно в шесть раз больше, чем человеческие нейроны сопоставимого развития, содержащиеся в чашке. Они также более зрелы электрофизиологически, образуют больше синапсов и намного ближе к нейронам в постнатальном мозге человека.
Видите ли вы какие-либо поведенческие различия у этих крыс, которые приобрели так много человеческих нейронов?
Нет. Нет никаких различий в когнитивных и двигательных задачах, в которых мы тестировали крыс. Мы также проверили, и у них нет припадков. Однако крыс можно научить ассоциировать стимуляцию нейронов человека с доставкой вознаграждения. Это открывает беспрецедентные возможности для изучения заболеваний головного мозга человека.
В какой момент ваши сборки и органоиды должны иметь какие-то юридические права?
Я думаю, что для культур in vitro это просто кластеры клеток. Мы не считаем их мозгами. Это становится более нюансированным, когда дело доходит до трансплантации животным.
Как биоэтики относятся к вашим экспериментам?
Мы тесно сотрудничаем с ними. На протяжении всего этого пути я активно участвовал в дискуссиях со специалистами по этике в Стэнфорде и за его пределами. Все проводимые нами эксперименты тщательно контролируются и обсуждаются со специалистами по этике. Мы не проводим эксперименты изолированно. Эксперименты обсуждаются до их проведения и, конечно же, во время их проведения. Мы поговорим о последствиях, плюсах и минусах.
Вы когда-нибудь думали о Франкенштейн история?
Я много думаю об этом. Но я думаю, что эта история не так уж актуальна для современной науки. В современном мире можно разрабатывать этичные технологии. Многое зависит от мотива исследователя. Моя долгосрочная цель — найти лечение и, возможно, лекарство от этих нарушений развития нервной системы. Это была моя Полярная звезда.
Несколько лет назад, еще до того, как она получила Нобелевскую премию за CRISPR, я спросил Дженнифер Дудну, беспокоит ли ее потенциальное неправильное использование этой технологии редактирования генов. Она ответила, что ее беспокоит «стремление в некоторых областях ринуться вперед, чтобы изменить человеческие эмбрионы». Вскоре после этого амбициозный исследователь из Шэньчжэня, Китай, объявил, что использовал CRISPR для пересмотра генетического кода двух человеческих младенцев. Вы когда-нибудь беспокоились о том, чтобы взять газету и обнаружить, что где-то ученый использовал вашу работу для преждевременного создания частей человеческого мозга?
Нет. Одна из вещей, которая отличает работу с органоидами от CRISPR, — это ресурсы, необходимые для экспериментов. Для редактирования генов с помощью CRISPR требуется лишь некоторая подготовка и немного ресурсов. Это возможно сделать на вашей кухне! То, что мы делаем, требует гораздо больше времени и денег. Поддерживать жизнь клеток в течение 900 дней довольно дорого и требует специальной подготовки и оборудования. Уже один этот факт дает нам некоторую передышку, чтобы обдумать наши открытия и их последствия.
Есть несколько мест с инфраструктурой и опытом, необходимыми для этого. Мы пытаемся воспроизвести развитие человеческого мозга, что занимает очень много времени. Раскрытие его скрытой инженерии занимает еще больше времени. Я работаю над этим каждый день последние 15 лет.
Насколько вы близки к некоторым решениям?
Я надеюсь, но я не хочу быть нереалистичным. Нам определенно лучше, чем 15 лет назад. Теперь у нас есть длинный список генов, связанных с аутизмом, и у нас есть новый инструмент для их изучения. Но нам все еще нужно понять, как эти мутировавшие гены вызывают нарушения в работе мозга, чтобы мы могли создавать эффективные лекарства.
Ваша история началась в Румынии 20 лет назад, когда вы не знали, что сказать родителям детей с аутизмом. Если бы вы сейчас вернулись в ту страну, что бы вы сказали?
Все, что я могу честно сказать, это то, что я надеюсь. Мы все еще далеки от лекарства. С другой стороны, в последние годы произошли огромные прорывы в лечении других, казалось бы, неразрешимых болезней. Это дает мне огромную надежду.
