Napredek pri urejanju genov: Raziskovalci zvezne države NC uporabljajo CRISPR za spremembo bakterij

RALEIGH – Recite temu uganka CRISPR.

Bakterije uporabljajo sisteme CRISPR-Cas kot prilagodljivi imunski sistem, da prenesejo napade sovražnikov, kot so virusi. Te sisteme so znanstveniki prilagodili za odstranitev ali rezanje in zamenjavo specifičnih zaporedij genetske kode v različnih organizmih.

[CRISPR-Cas je prilagodljivi imunski sistem, ki obstaja v večini bakterij in arhej, ki jim preprečuje okužbo s fagi, virusi in drugimi tujimi genetskimi elementi, navaja Nacionalni inštitut za zdravje.]

Toda v novi študiji so raziskovalci Državne univerze Severne Karoline pokazali, da lahko virusi, zasnovani s sistemom CRISPR-Cas, preprečijo bakterijsko obrambo in selektivno spremenijo ciljno bakterijo – tudi če so druge bakterije v neposredni bližini.

»Virusi so zelo dobri pri pošiljanju tovora. Tukaj uporabljamo bakterijski virus, bakteriofag, za dostavo CRISPR bakterijam, kar je ironično, saj bakterije običajno uporabljajo CRISPR za ubijanje virusov,« je dejal. Rodolphe Barrangou, Todd R. Klaenhammer, ugledni profesor za hrano, bioprocesiranje in prehranske vede na zvezni državi NC in ustrezni avtor prispevka, ki opisuje raziskavo, objavljeno danes v Zbornik National Academy of Sciences. »Virus v tem primeru cilja E. coli tako, da mu dostavimo DNK. To je kot uporaba virusa kot brizge.«

Raziskovalci NC State so namestili dva različna inženirstva bakteriofaga za dostavo koristnih obremenitev CRISPR-Cas za ciljno urejanje E. coli, najprej v epruveti in nato v sintetičnem okolju prsti, ustvarjenem za posnemanje prsti – kompleksnem okolju, ki lahko hrani številne vrste bakterij.

Oba izdelana bakteriofaga, imenovana T7 in lambda, sta uspešno našla in nato dostavila tovor v E. coli gostiteljica na laboratorijski klopi. Te koristne obremenitve so izražale bakterijske florescentne gene in manipulirale z odpornostjo bakterije na antibiotik.

Raziskovalci so nato uporabili lambda za dostavo tako imenovanega urejevalnika baz citozina E. coli gostitelj. Namesto CRISPR-jevega včasih ostrega cepljenja zaporedij DNK je ta osnovni urejevalnik spremenil samo eno črko E. coli 's DNK, ki kaže na občutljivost in natančnost sistema. Te spremembe so onesposobile določene bakterijske gene, ne da bi pri tem povzročile druge spremembe E. coli.

»Tu smo uporabili osnovni urejevalnik kot nekakšno programabilno stikalo za vklop in izklop za gene E. coli. Z uporabo sistema, kot je ta, lahko naredimo zelo natančne enočrkovne spremembe v genomu brez preloma dvojne verige DNK, ki je običajno povezan s ciljanjem na CRISPR-Cas,« je povedal Matthew Nethery, nekdanji dr. študent in glavni avtor študije.

Končno so raziskovalci prikazali urejanje na kraju samem z uporabo izdelanega ekosistema (EcoFAB), napolnjenega s sintetičnim medijem tal iz peska in kremena, skupaj s tekočino, za posnemanje talnega okolja. Raziskovalci so vključili tudi tri različne vrste bakterij, da bi preizkusili, ali lahko fag specifično locira E. coli znotraj sistema.

"V laboratoriju lahko znanstveniki preveč poenostavijo stvari," je dejal Barrangou. "Primernejše je modeliranje okolij, zato smo namesto juhe v epruveti želeli preučiti okolja v resničnem življenju."

Raziskovalci so lambdo vstavili v izdelan ekosistem. Pokazal je dobro učinkovitost pri iskanju E. coli in izvajanje ciljnih genetskih sprememb.

"Ta tehnologija bo naši ekipi in drugim omogočila, da odkrijejo genetsko osnovo ključnih bakterijskih interakcij z rastlinami in drugimi mikrobi v visoko nadzorovanih laboratorijskih okoljih, kot so EcoFABs," je dejal Trent Northen, znanstvenik na Ministrstvu za energijo Lawrence Berkeley National Laboratory. (Berkeley Lab), ki sodeluje z Barrangoujem.

»To vidimo kot mehanizem za pomoč mikrobiomu. Določeno bakterijo lahko spremenimo, preostali del mikrobioma pa ostane nepoškodovan,« je dejal Barrangou. »To je dokaz koncepta, ki bi ga lahko uporabili v kateri koli kompleksni mikrobni skupnosti, kar bi lahko pomenilo boljše zdravje rastlin in boljše zdravje prebavil – okolja, ki so pomembna za hrano in zdravje.

"Navsezadnje ta študija predstavlja naslednje poglavje dostave CRISPR - uporaba virusov za dostavo strojev CRISPR v kompleksnem okolju."

Raziskovalci nameravajo to delo nadaljevati s testiranjem tehnike faga CRISPR z drugimi bakterijami, povezanimi s prstjo. Pomembno je, da to ponazarja, kako je mogoče manipulirati z mikrobnimi skupnostmi v tleh, da bi nadzorovali sestavo in delovanje bakterij, povezanih z rastlinami v izdelanih ekosistemih, da bi razumeli, kako povečati rast rastlin in spodbujati zdravje rastlin, kar je v širokem interesu za trajnostno kmetijstvo.

Financiranje je zagotovilo m-CAFEs Microbial Community Analysis & Functional Evaluation in Soils, znanstveno osredotočeno področje, ki ga vodi Nacionalni laboratorij Lawrence Berkeley in ga podpira Ministrstvo za energijo ZDA po pogodbi št. DE-AC02-05CH11231, s skupnimi prizadevanji, vključno z UC Berkeley in Innovative Genomics Institute. Soavtorji prispevka so Nethery, nekdanji podoktorski raziskovalec države NC Claudio Hidalgo-Cantabrana in podiplomska študentka države NC Avery Roberts.

(C) NCSU