Fluorescenčna mikroskopija živih celic je nepogrešljivo orodje za proučevanje dinamike bioloških sistemov. Toda številni biološki procesi – kot je na primer delitev bakterijskih celic in mitohondrijev – se pojavljajo občasno, zaradi česar jih je težko zajeti.
Nenehno slikanje vzorca pri visoki hitrosti sličic bi zagotovilo, da bodo te delitve zagotovo zabeležene, ko se zgodijo. Toda prekomerno fluorescenčno slikanje povzroči fotobeljenje in lahko prezgodaj uniči žive vzorce. Nižja hitrost sličic v sekundi pa tvega, da boste zamudili zanimive dogodke. Potreben je način, kako predvideti, kdaj se bo dogodek zgodil, in nato mikroskopu dati ukaz, naj začne slikati z visoko hitrostjo.
Raziskovalci na švicarskem zveznem inštitutu za tehnologijo v Lausanni (EPFL) so ustvarili prav tak sistem. Ekipa je razvila okvir za pridobivanje na podlagi dogodkov (EDA), ki avtomatizira nadzor mikroskopa za podrobno sliko bioloških dogodkov, hkrati pa omejuje stres na vzorcu. EDA z uporabo nevronskih mrež za zaznavanje subtilnih predhodnikov zanimivih dogodkov prilagaja parametre zajemanja – kot je hitrost slikanja ali trajanje meritve – kot odziv.
»Inteligentni mikroskop je nekaj podobnega samovozečemu avtomobilu. Obdelati mora določene vrste informacij, subtilne vzorce, na katere se nato odzove s spremembo svojega vedenja,« pojasnjuje glavni raziskovalec Suliana Manley v izjavi za javnost. "Z uporabo nevronske mreže lahko zaznamo veliko bolj subtilne dogodke in jih uporabimo za spodbujanje sprememb v hitrosti pridobivanja."
Okvir EDA, opisan v Naravne metode, sestoji iz povratne zanke med slikovnim tokom v živo in kontrolami mikroskopa. Raziskovalci so uporabili programsko opremo Micro-Manager za zajemanje slik iz mikroskopa in nevronsko mrežo, usposobljeno za označene podatke, za njihovo analizo. Za vsako sliko omrežni izhod deluje kot parameter odločanja za preklapljanje med počasnim in hitrim slikanjem.
Prepoznavanje dogodka
Da bi prikazali svojo novo tehniko, so Manley in njegovi sodelavci integrirali EDA v mikroskop s takojšnjo strukturirano osvetlitvijo in ga uporabili za zajemanje izjemno ločljivih časovnih zamikov filmov mitohondrijskih in bakterijskih delitev.
Delitev mitohondrijev je nepredvidljiva, običajno se zgodi vsakih nekaj minut in traja več deset sekund. Da bi napovedali začetek delitve, je ekipa usposobila nevronsko mrežo za zaznavanje zožitev, spremembo oblike mitohondrijev, ki vodi do delitve, v kombinaciji s prisotnostjo proteina, imenovanega DRP1, ki je potreben za spontane delitve.
Nevronska mreža ustvari toplotni zemljevid "rezultatov dogodkov" z višjimi vrednostmi (ko so tako zožitve kot ravni DRP1 visoke), ki označujejo lokacije na sliki, kjer je bolj verjetno, da bo prišlo do delitve. Ko rezultat dogodka preseže mejno vrednost, se hitrost slikanja poveča, da se podrobno zajamejo dogodki delitve. Ko se rezultat zniža na drugi prag, mikroskop preklopi na slikanje z nizko hitrostjo, da prepreči izpostavljanje vzorca pretirani svetlobi.
Raziskovalci so izvedli EDA na celicah, ki izražajo fluorescenčne oznake, usmerjene v mitohondrije. Med vsako meritvijo EDA je mreža v povprečju devetkrat prepoznala prekurzorje za delitev bakterij. To je preklopilo hitrost slikanja s počasne (0.2 sličice/s) na hitro (3.8 sličice/s) za povprečno 10 s, kar je povzročilo hitro slikanje za 18 % sličic. Ugotavljajo, da se je veliko mest nabralo DRP1, vendar ni privedlo do delitve. Ta spletna mesta niso sprožila omrežja, kar dokazuje njegovo sposobnost diskriminacije zanimivih dogodkov.
Za primerjavo je ekipa zbirala tudi slike pri konstantnih počasnih in hitrih hitrostih. EDA je povzročila manj fotobeljenja vzorcev kot hitro slikanje s fiksno hitrostjo, kar je omogočilo daljša opazovanja vsakega vzorca in povečalo možnosti za zajemanje redkih dogodkov mitohondrijske delitve. V nekaterih primerih se je vzorec obnovil po fotobeljenju med fazami počasnega slikanja, kar je omogočilo večji kumulativni odmerek svetlobe.
Medtem ko je bilo beljenje pri EDA večje kot pri konstantnem počasnem slikanju, so številne seje EDA dosegle 10 minut brez poslabšanja zdravja vzorca. Raziskovalci so tudi ugotovili, da je EDA bolje razrešila zožitve pred delitvijo, pa tudi napredovanje membranskih stanj, ki vodijo do cepitve, kot so jih zajeli izbruhi hitrih slik.
"Potencial inteligentne mikroskopije vključuje merjenje, kaj bi standardne pridobitve zamudile," pojasnjuje Manley. "Zajamemo več dogodkov, merimo manjše omejitve in lahko podrobneje sledimo vsaki delitvi."
Odkrivanje delitve bakterij
Nato so raziskovalci uporabili EDA za preučevanje celične delitve v bakterijah C. crescentus. Bakterijski celični cikel poteka v časovni lestvici deset minut, kar ustvarja posebne izzive za mikroskopijo živih celic. Podatke so zbirali pri počasni hitrosti slikanja 6.7 sličic/uro, hitri hitrosti slikanja 20 sličic/uro ali spremenljivi hitrosti, ki jo je preklopil EDA.
Skupina je ugotovila, da lahko mreža za zaznavanje dogodkov, razvita za mitohondrijske zožitve, prepozna končne faze bakterijske delitve brez dodatnega usposabljanja - verjetno zaradi podobnosti v obliki zožitve in prisotnosti funkcionalno podobnega molekularnega markerja.
Izboljšana mikroskopska tehnika vidi žive celice s sedemkrat večjo občutljivostjo
Ponovno je EDA zmanjšala fotobeljenje v primerjavi s konstantnim hitrim slikanjem in izmerila zožitve z znatno manjšimi povprečnimi premeri kot pri konstantnem počasnem slikanju. EDA je omogočil slikanje celotnega celičnega cikla in zagotovil podrobnosti o delitvi bakterijskih celic, ki jih je težko zajeti s fiksno hitrostjo slikanja.
pripoveduje Manley Svet fizike da ekipa načrtuje tudi usposabljanje nevronskih mrež za zaznavanje različnih vrst dogodkov in njihovo uporabo za sprožanje različnih odzivov strojne opreme. "Na primer, predvidevamo izkoriščanje optogenetskih motenj za modulacijo transkripcije v ključnih trenutkih diferenciacije celic," pojasnjuje. "Razmišljamo tudi o uporabi zaznavanja dogodkov kot sredstva za stiskanje podatkov, pri čemer za shranjevanje ali analizo izberemo dele podatkov, ki so najbolj pomembni za dano študijo."
- Da bi raziskovalcem omogočili implementacijo EDA na najrazličnejše mikroskope, skupina zagotavlja nadzorni okvir kot odprtokodni vtičnik za programsko opremo Micro-Manager.
