Denna gång för ett år sedan, Steve Horvath letade efter pangolin-DNA. Den forntida fjällande myrsötaren skulle vara en första för hans samling, som då var cirka 200 däggdjur stark. "Jag hade inget av den beställningen, vilket är anledningen till att jag desperat ville ha dem," mindes han.
Sedan sommaren 2017 har Horvath, som tills nyligen var en forskare mot åldrande vid University of California, Los Angeles, har spenderat så mycket som 10 timmar om dagen på att skriva e-postmeddelanden till djurparker, museer, akvarier och laboratorier. Han har deltagit i samtal om fladdermöss och tasmanska djävlar för att träffa deras djurhållare. Han har sträckt sig ut till världens avlägsna hörn och bett om DNA från flygande rävar, vervetapor, minigrisar och grönlandsvalar.
Med det stora menageriet av prover har han byggt beräkningsklockor som kan beräkna åldern på varelser så olika som smuss, koalor, zebror, grisar och "varje val du kan namnge", sa han, bara genom att titta på deras DNA. Men det var bara steg mot fullbordandet av Horvaths ambitiösa månbild av ett projekt: en universell klocka som kunde mäta den biologiska åldern hos vilket däggdjur som helst.
Att mäta ålder kanske inte verkar vara svårare än att använda närmaste klocka eller kalender. Men kronologisk ålder är ett ofullständigt mått eftersom vissa individer och vävnader visar effekterna av ålder snabbare än andra. I decennier har forskare sökt efter ett objektivt och mångsidigt sätt att mäta biologiskt åldrande, förändringarna i hälsosam funktion över tid. "Du vill ha en biomarkör som noggrant mäter åldrarna i många olika vävnader och celltyper", säger Horvath, som lämnade UCLA i år för att bli huvudutredare vid Altos Labs, en bioteknikstartup som arbetar mot föryngring av celler.
Horvath och hans kollegor färdigställde en version av pan-däggdjursklockan tidigare i år. Nu hoppas han och andra forskare kunna identifiera de molekylära processer som är gemensamma för olika varelser som gör en sådan klocka möjlig. Att förstå varför klockor som den här fungerar, tror Horvath, kan hjälpa oss att leda oss till vad han kallar "den sanna grundorsaken till åldrande."
Hans klockor är baserade på analyser av de kemiska taggar som kallas metylgrupper som hänger på DNA som berlocker på ett armband och hjälper till att kontrollera genaktivitet. De är produkter av epigenetik (bokstavligen, "över genetik"), fältet som studerar ärftlig information som inte är skriven i den genetiska koden. För ett dussin år sedan började Horvath och hans kollegor använda sitt kunnande för att bygga klockorna, först för att bedöma åldern på DNA från saliv och senare för att bestämma åldern på blod, lever och andra individuella vävnader.
Många biologer var skeptiska till en början eftersom klockorna var rotade i statistik snarare än en förståelse för biomolekylära mekanismer. Ändå klarade klockornas noggrannhet tester och skickade krusningar genom det biomedicinska samhället. Forskare började använda Horvath-klockor i sin forskning för att mäta åldrande av celler eftersom klockorna var bättre avgörare av kroppens tillstånd och risken för sjukdom än kronologisk ålder. "Epigenetiska klockor är närmare den faktiska åldrandeprocessen än någon annan biomarkör," sa Vadim Gladyshev, en biokemist vid Brigham and Women's Hospital och Harvard Medical School som studerar cancer och åldrande. Nu leder klockorna till att vissa forskare omprövar sina idéer om vad åldrande är, såväl som dess koppling till sjukdomar.
"Jag har nu medarbetare som arbetar mycket med bröstcancer och [börjar] tänka på," om du har långt framskridet biologiskt åldrande, är det också informativt för bröstcancer? Sara Hägg, en molekylär epidemiolog vid Karolinska Institutet i Stockholm, Sverige. Om klockorna på ett användbart sätt kan belysa hur man stoppar åldrandeprocessen från att utlösa åldersrelaterade störningar, tillade hon, "vi skulle kunna förhindra inte bara en sjukdom utan många."
Att se en signal
Gång på gång under de senaste decennierna trodde biologiska forskare att en klocka för åldrande var inom räckhåll. Till exempel lärde de sig i början av 1960-talet att celler som växer i kultur inte är odödliga utan i stället dör efter bara 40-60 omgångar av replikering, vilket antydde att celler hyser en slags åldrande klocka. 1982 trodde forskare att de kunde ha hittat klockans mekanism när de isolerade telomerer, DNA-proteinkomplex i ändarna av kromosomerna som förkortas varje gång en cell delar sig; När telomererna blir kritiskt korta dör cellerna.
Men telomerer fungerade inte som en åldrande klocka. Korrelationen mellan telomerlängd med ålder och dödlighet är svag hos människor och obefintlig hos vissa andra arter. "Telomere [längd] spårar faktiskt inte ålder. Det spårar bara cellproliferation”, sa Ken Raj, en huvudutredare vid Altos Labs.
Som ett alternativ till telomerlängd började Horvath 2009 arbeta på en klocka baserad på RNA-transkripten av en cells aktiva gener, mallarna för de proteiner som definierar en cell och låter den fungera. Under de följande två åren försökte han få det tillvägagångssättet att fungera, utan resultat: transkriptionsdata var alldeles för bullriga.
Men 2010 svarade Horvath på en begäran om hjälp från en kollega vid UCLA. För att studera möjliga samband mellan sexuell läggning och epigenetik, samlade forskaren saliv från enäggstvillingar som skilde sig åt i sexuell läggning, med hypotesen att DNA i deras salivceller kan avslöja några konsekventa skillnader i metyleringsmönster. Horvaths tvillingbror är gay; Horvath är heterosexuell. De gav sitt spott.
Studiens analys tittade på platser i DNA:t där cytosinbaser finns och kontrollerade vilka av dem som var metylerade. (Cytosiner är de enda baserna som metylgrupper fäster vid.) En nyligen introducerad lab-on-a chip-teknologi gjorde det enkelt att testa tiotusentals cytosinställen i varje cells DNA. När kollegan behövde en statistiker för att analysera uppgifterna, anmälde Horvath sina tjänster frivilligt.
Han hittade inte vad de letade efter. "Det fanns ingen som helst signal för homosexualitet," sa Horvath. "Men eftersom data fanns på min dator, sa jag, låt mig titta på åldrande effekter," eftersom åldrarna på tvillingarna i studien sträckte sig över decennier.
Fram till dess hade Horvath undvikit epigenetiska data i sin egen forskning. Förhållandet mellan metyleringsmönster och genuttryck är rörigt och indirekt, och det hade verkat osannolikt att visa mycket användbar koppling till åldrande. Men nu när han hade denna oväntade epigenetiska data till sitt förfogande verkade det inte skada att titta.
Horvath började matcha metyleringsmönstren med tvillingarnas åldrar. I ett salivprov - eller något prov från vilken vävnad som helst - kommer inte alla celler att visa samma metyleringsmönster. Men andelen celler som är metylerade vid ett givet cytosin i DNA kan mätas. I ett prov, till exempel, kan 40 % av cellerna vara metylerade vid en viss position; i en annan kan den andelen vara 45 % eller 60 %.
Till sin förvåning fann Horvath ett starkt samband mellan ålder och andelen celler med metylering, även när han tittade på bara en plats i DNA:t. Att titta på fler platser ökade noggrannheten.
"Detta förändrade allt för mig", sa han. "När jag tittade på signalen för åldrande, blåste det bort mig."
Horvath byggde en modell som förutspådde en persons ålder från metyleringsstatusen för cirka 300 cytosiner över miljontals celler i ett salivprov. "Du spottar i en kopp, och vi kan mäta din ålder," sa han.
Snart byggde han epigenetiska klockmodeller för att utvärdera de biologiska åldrarna för blod, lever, hjärna och olika andra vävnader. Först mätte han proportionerna av celler i varje prov som visade metylering på specifika platser. Från dessa data skapade han profiler av vävnaderna som beskrev proportionerna av celler metylerade på varje plats.
För att bygga en klocka matade han en dator med tusentals epigenetiska profiler tillsammans med åldern på varje profilerad vävnad. Genom maskininlärning kopplade datorn åldrar till metyleringsmönster. Det minskade också antalet webbplatser som behövs för att förutsäga ålder. Datorn viktade sedan betydelsen av varje webbplatss metylering i sina beräkningar för att skapa den bästa prediktiva formeln för ålder, som Horvath testade på en separat uppsättning prover av kända åldrar.
Inom två år hade han kombinerat deras separata vävnadsåldringsklockor till en formel för en "pan-vävnad"-klocka, publicerad 2013. Pan-vävnadsklockan var "the game changer", sa Daniel Belsky, en epidemiolog vid Columbia Mailman School of Public Health. Formeln tillämpas på alla mänskliga celler som innehåller DNA. Och vem som helst kunde använda det - Horvath lade ut programvaran på internet. Genom att ladda upp sina egna metyleringsdata kunde biologer ta reda på hur mycket tid som hade tagit på celler i deras prover.
Kvantifiera nedgång
Horvaths pannvävnadsklocka var mirakulöst exakt när det gällde att förutsäga kronologisk ålder. Det verkade också spegla viktiga underliggande skillnader mellan kronologisk och biologisk ålder. Forskare upptäckte att när den epigenetiska klockan uppskattade att någons ålder var högre än deras kronologiska ålder, stod personen inför en högre risk för sjukdom och död. När klockan uppskattade att någon var yngre sjönk deras risk. Även om den epigenetiska klockan härleddes från kronologisk åldersdata, förutspådde dess algoritm dödlighet bättre än vad ålder gjorde.
Så i slutet av 2014 bestämde sig Horvath för att explicit spåra biologisk ålder. Han och hans kollegor, bl.a Morgan Levine (en patologiforskare vid Yale University som nyligen gick med i Altos Labs) och Luigi Ferrucci från National Institute on Aging, tränade en algoritm på ett sammansatt mått som inkluderade kronologisk ålder såväl som resultaten av nio blodkemiska tester som förutsäger sjukdom och dödlighet. Uppgifterna kom från blodet från mer än 9,900 XNUMX vuxna i National Health and Nutrition Examination Survey. Den resulterande klockan, DNAm PhenoAge, publicerad 2018, förutspådde total dödlighet och risken för hjärt-kärlsjukdomar, lungsjukdomar, cancer och diabetes, bland andra utfall. Ett år senare släppte Horvath och ett team under ledning av Ake T. Lu från UCLA en ännu mer exakt prediktor för tid till döden, Grim Age, som tittade på en persons kön, kronologiska ålder, rökhistoria och blodproteindödlighetsmarkörer.
Ett nytt verktyg från Belsky och hans kollegor, introducerat 2020 och uppdaterat tidigare i år, fungerar som en åldrande hastighetsmätare. I att skapa sina Åldringstakten biomarkör, kvantifierade de förändringshastigheten i 19 markörer för organfunktion vid fyra åldrar, sammanställde dem till ett enda index och modellerade det med metylering. "Vi kvantifierar faktiskt den pågående processen med åldersrelaterad nedgång och systemintegritet," sa Belsky. De som åldras snabbare med detta mått dör yngre, sa han och tillade att det förutsäger dödlighet ungefär lika bra som GrimAge och kan förutsäga stroke och demens ännu bättre.
Ålderlig fråga
Under 2017 kontaktade representanter för Paul G. Allen Family Foundation Horvath efter ett av hans samtal. De gillade hans arbete och föreslog att han skulle drömma stort, eftersom stiftelsen stöder högriskprojekt. Hitta ett projekt som ingen annan skulle finansiera, sa de.
Det tog inte Horvath lång tid att föreslå en åldrande klocka som skulle gälla alla ryggradsdjur. Förslaget gick igenom - det var besynnerligt nog - men när Horvath kom att inse omfattningen av vad det skulle innebära, förvandlades planen till en relativt återhållsam klocka för alla däggdjur.
I januari 2021 hade Horvath metyleringsdata från 128 däggdjursarter, och han ställde upp sin klocka på preprint-servern biorxiv.org. "Samma matematisk formel, samma cytosiner för en mus eller en råtta eller en hund eller en gris. Vi kan mäta åldrande hos alla dessa arter, säger Horvath. Ändå letade han jorden runt efter mer.
På sensommaren förra året var Horvath i kontakt med Darren Pietersen, en pangolinexpert vid Tikki Hywood Foundation i Harare, Zimbabwe, och erbjuder honom förnödenheter för att samla in data från pangoliner och flera andra arter. Ingen visste ens säkert hur länge pangoliner lever. Vissa officiella konton sa 15 till 20 år, men Pietersen trodde att åtminstone vissa typer lever längre. "Det enda djuret som vi åldrade nyligen var ungefär 34 år gammalt (men med en ganska stor felmarginal)", skrev han.
Från de tillhandahållna vävnadsdata byggde Horvath en pangolinklocka, ytterligare en livslängdstimer att lägga till sin samling. "Du vill ha en grisklocka, jag har en grisklocka. Jag har en klocka för kängurur och för elefanter, sa Horvath. Varje artspecifik klocka var en välsignelse för forskare på området. Elefantforskare, till exempel, ville ha elefantklockan så att de kunde fastställa åldersstrukturen hos vilda populationer för att hjälpa bevarandeinsatser.
Men en klocka som slår samman dem alla kan hjälpa till att svara på en mer grundläggande fråga: Vad är åldrande? En syn är att din kropp åldras som dina skor, gradvis bleknar och faller isär från slitage. Men de framgångsrika förutsägelserna från pan-däggdjursklockan antyder att något också får celler att misslyckas enligt en viss tidtabell, kanske på grund av utvecklingsgener som inte stängs av när deras arbete är klart. "Detta tyder på ett inslag av determinism i åldrande," sa Raj, en av klockans mer än 100 byggare.
Data från metyleringsklockor tyder på att åldrandet börjar väldigt tidigt, långt innan kroppen bryts ner. I en 2021 papper, beskriver Gladyshev och hans kollegor en metyleringsklocka som daterar stadier av däggdjursutveckling. De fann att under tidig embryogenes hos möss sänker en slags föryngring embryots ålder till noll. Biologiskt åldrande fortsätter sedan snabbt, även om mänskliga barn utan tvekan blir starkare, inte svagare, under denna tid, och dödligheten hos människor minskar fram till ungefär 9 års ålder. "Det är för mig mycket djupgående eftersom det spikar denna fråga om åldrande till en process som är oskiljaktig från utvecklingsprocessen," sa Raj.
Två färska studier av den nakna mullvadsråttan, en gnagare med en osannolikt lång livslängd på 37 år, visar att djuret åldras epigenetiskt, även om chanserna att dö inte ökar med kronologisk ålder. "Jag tror att dödligheten inte är det bästa måttet på åldrande," sade Gladyshev, som ledde en av studierna. "Åldrande är en oundviklig konsekvens av att vara vid liv."
Åldrandet återspeglar naturligtvis fortfarande effekterna av erfarenhet, beteende och miljö. Rökning och solexponering kan till exempel påskynda det, mätt med metylering och andra markörer, och träning eller en lågkaloridiet kan stoppa det. I ett arbete som publicerades i mars förra året, en epigenetisk klocka skräddarsydda för murmeldjur visade att viloläge bromsar åldrandet, och ett papper publicerade förra veckan visade att samma sak gäller för fladdermöss. En klocka gjord för rhesusmakaker antyder att orkanen Maria 2017 påskyndade åldrandet i en koloni av aporna på en ö utanför Puerto Ricos kust.
ARVSYND
Ingen vet helt varför klockorna fungerar. Vissa men inte alla gener och molekylära vägar som är involverade har identifierats, och forskare lär sig fortfarande hur metyleringsmönster påverkar beteendet och hälsan hos celler, vävnader och organ. "Det kommer tillbaka till vad jag kallar 'konstruktionens arvsynd'," sa Horvath. "Den är baserad på en [statistisk] regressionsmodell som på någon nivå är agnostisk för biologi."
För att sona denna synd har Raj och Horvath börjat leta efter biologiska korrelat för epigenetiskt åldrande. Störningar i de biokemiska vägar som kroppen använder för att känna sitt behov av näringsämnen långsamt åldrande, upptäckte de nyligen, i enlighet med effekterna av kaloribegränsade dieter på åldrandet. Att spåra ur mitokondriernas funktion påskyndar det. Klockan spårar även stamcellers mognad. Om dessa processer är sammankopplade på en djupare nivå kan epigenetiska klockor avslöja förenande mekanismer för åldrande, skrev författarna i en 2022 papper i Naturåldring.
Vad dessa förenande mekanismer kan vara eller varför metyleringsstatus spårar åldrandet så bra är dock ännu inte helt bestämt. "Vi vet inte riktigt om epigenetiska klockor är kausalt kopplade till åldrande," sa Hägg.
Även om de är det, mäter epigenetiska klockor nästan säkert bara en del av vad som sker under åldrandet, sa Matt Kaeberlein, en forskare vid University of Washington School of Medicine i Seattle som studerar åldrandets biologi. "Om de faktiskt mäter mer än en enda dimension av biologisk ålder är inte klart," sa han. "Detta är en del av problemet här - sammanblandningen av epigenetisk ålder med biologisk ålder. De är inte likvärdiga enligt min uppfattning."
Raj spekulerar i att metyleringsförändringarna återspeglar en förlust av cellulär identitet med åldern. Alla celler i kroppen har samma DNA, så det som gör en levercell till en levercell och en hjärtcell till en hjärtcell är mönstret för genuttryck, som epigenetiken styr. Eftersom förändringar i metylering ackumuleras med åldern, kan vissa av dessa kontroller gå förlorade, ersättas av återkommande utvecklingsprogram som bör stängas av, föreslår Raj.
Även om metyleringsklockor kan vara de mest exakta övervakarna av biologisk ålder för nu, vissa studier föreslår det finns utrymme för förbättringar. En mer exakt prediktor kan kombinera kvantifierbara cellulära egenskaper - säg protein-, metabolit- eller genuttrycksnivåer - med fysiologiska signaler och ett skörhetsindex. "Vi kan mäta så många saker i en människa nu", sa Hägg. "Ju fler av dessa saker du kvantifierar, desto mer exakt kommer du att fånga ditt åldrande."
Metyleringsklockor har också begränsade kliniska användningsområden, varnade Hägg. Människor kan köpa en avläsning av sin biologiska ålder från olika kommersiella källor, men inte bara är resultaten ofta inkonsekventa, de saknar klinisk relevans eftersom klockorna var avsedda för analys på gruppnivå inom forskning. "De är inte byggda för att vara förutsägande på individuell nivå," sa hon.
Och även om någon ändrar sin livsstil på ett sätt som sänker deras biologiska ålder mätt med dessa klockor, kommer de att ha ett längre liv eller en lägre risk för sjukdom? "Vi vet inte det ännu," sa Kaeberlein.
Horvath förbereder nu ett papper om sin pan-däggdjursklocka för inlämning till en dagbok. Även om han till synes har nått sitt mål, tjatar fortfarande luckor i hans samling på honom. I maj korresponderade han med seniorkuratorer på ett museum i Australien om att skaffa vävnad från pungdjursmullvadar, en liten, i stort sett blind varelse som tillbringar större delen av sin tid under jorden. "Vi har redan genererat data från 348 däggdjursarter, men vi skulle vilja lägga till fler," sa han.
När Horvath föreslog detta projekt satte han sig för att analysera 30 arter, men 30 blev snart 50, sedan 100, sedan mer än tre gånger så mycket. "Jag måste ta fart på mig själv," sa han, "eftersom jag har den här impulsen att samla in mer."
