RALEIGH – Kalla det en CRISPR gåta.
Bakterier använder CRISPR-Cas-system som adaptiva immunsystem för att motstå attacker från fiender som virus. Dessa system har anpassats av forskare för att ta bort eller skära och ersätta specifika genetiska kodsekvenser i en mängd olika organismer.
[CRISPR-Cas är ett adaptivt immunsystem som finns i de flesta bakterier och arkéer, vilket förhindrar dem från att infekteras av fager, virus och andra främmande genetiska element, enligt National Institute of Health.]
Rodolphe Barrangou (NCSU-bild)
Men i en ny studie visar forskare från North Carolina State University att virus konstruerade med ett CRISPR-Cas-system kan omintetgöra bakterieförsvar och göra selektiva förändringar av en riktad bakterie – även när andra bakterier är i närheten.
"Virus är väldigt bra på att leverera nyttolaster. Här använder vi ett bakterievirus, en bakteriofag, för att leverera CRISPR till bakterier, vilket är ironiskt eftersom bakterier normalt använder CRISPR för att döda virus", sa Rodolphe Barrangou, Todd R. Klaenhammer Distinguished Professor of Food, Bioprocessing and Nutrition Sciences vid NC State och motsvarande författare till ett papper som beskriver forskningen som publicerades idag i Proceedings of the National Academy of Sciences. "Viruset i det här fallet är mål E.coli genom att leverera DNA till den. Det är som att använda ett virus som en spruta.”
NC State-forskarna använde två olika konstruerade bakteriofager för att leverera CRISPR-Cas-nyttolaster för riktad redigering av E.coli, först i ett provrör och sedan i en syntetisk jordmiljö skapad för att efterlikna jord – en komplex miljö som kan hysa många typer av bakterier.
Båda de konstruerade bakteriofagerna, kallade T7 och lambda, hittade framgångsrikt och levererade sedan nyttolaster till E.coli värd på labbbänken. Dessa nyttolaster uttryckte bakteriella florescerande gener och manipulerade bakteriens resistens mot ett antibiotikum.
Forskarna använde sedan lambda för att leverera en så kallad cytosinbasredigerare till E.coli värd. Istället för CRISPRs ibland hårda klyvning av DNA-sekvenser ändrade denna basredigerare bara en bokstav i E coli's DNA, som visar systemets känslighet och precision. Dessa förändringar inaktiverade vissa bakteriella gener utan att göra andra ändringar E.coli.
"Vi använde en basredigerare här som en slags programmerbar på/av-brytare för gener i E.coli. Genom att använda ett system som detta kan vi göra mycket exakta enbokstavsförändringar i genomet utan dubbelsträngat DNA-brott som vanligtvis förknippas med CRISPR-Cas-målinriktning”, säger Matthew Nethery, en före detta NC State Ph.D. student och huvudförfattare till studien.
Slutligen visade forskarna redigering på plats genom användning av ett tillverkat ekosystem (EcoFAB) laddat med ett syntetiskt jordmedium av sand och kvarts, tillsammans med vätska, för att efterlikna en jordmiljö. Forskarna inkluderade också tre olika typer av bakterier för att testa om fagen specifikt kunde lokalisera E.coli inom systemet.
"I ett labb kan forskare förenkla saker," sa Barrangou. "Det är att föredra att modellera miljöer, så snarare än soppa i ett provrör ville vi undersöka verkliga miljöer."
Forskarna infogade lambda i det tillverkade ekosystemet. Det visade god effektivitet i att hitta E.coli och göra de riktade genetiska förändringarna.
"Denna teknik kommer att göra det möjligt för vårt team och andra att upptäcka den genetiska grunden för viktiga bakteriella interaktioner med växter och andra mikrober i högt kontrollerade laboratoriemiljöer som EcoFABs," säger Trent Northen, en forskare vid Department of Energy's Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) som samarbetar med Barrangou.
"Vi ser detta som en mekanism för att hjälpa mikrobiomet. Vi kan göra en förändring av en viss bakterie och resten av mikrobiomet förblir oskadd, säger Barrangou. "Detta är ett proof of concept som skulle kunna användas i alla komplexa mikrobiella samhällen, vilket kan leda till bättre växthälsa och bättre hälsa i mag-tarmkanalen - miljöer av betydelse för mat och hälsa.
"I slutändan representerar den här studien nästa kapitel av CRISPR-leverans – att använda virus för att leverera CRISPR-maskiner i en komplex miljö."
Forskarna planerar att främja detta arbete genom att testa fag CRISPR-tekniken med andra jord-associerade bakterier. Viktigt är att detta illustrerar hur mikrobiella samhällen i marken kan manipuleras för att kontrollera sammansättningen och funktionen av bakterier som är associerade med växter i tillverkade ekosystem för att förstå hur man kan förbättra växttillväxt och främja växthälsa, vilket är av brett intresse för ett hållbart jordbruk.
Finansiering tillhandahölls av m-CAFEs Microbial Community Analysis & Functional Evaluation in Soils, ett vetenskapsfokusområde som leds av Lawrence Berkeley National Laboratory och stöds av US Department of Energy enligt kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231, med samarbetsinsatser inklusive UC Berkeley och Innovative Genomics Institute. Medförfattare till artikeln inkluderar Nethery, tidigare NC State postdoktoralforskare Claudio Hidalgo-Cantabrana och NC State doktorand Avery Roberts.
(C) NCSU
