Fluorescensmikroskopi av levande celler ger ett oumbärligt verktyg för att studera dynamiken i biologiska system. Men många biologiska processer – som bakteriell celldelning och mitokondriell delning, till exempel – sker sporadiskt, vilket gör dem utmanande att fånga.
Att kontinuerligt avbilda ett sampel med en hög bildhastighet skulle säkerställa att när sådana uppdelningar inträffar kommer de definitivt att registreras. Men överdriven fluorescensavbildning orsakar fotoblekning och kan förstöra levande prover i förtid. En långsammare bildfrekvens riskerar samtidigt att missa intressanta händelser. Vad som behövs är ett sätt att förutsäga när en händelse är på väg att inträffa och sedan instruera mikroskopet att påbörja höghastighetsavbildning.
Forskare vid Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL) har skapat just ett sådant system. Teamet utvecklade ett ramverk för händelsestyrt förvärv (EDA) som automatiserar mikroskopkontroll för att avbilda biologiska händelser i detalj samtidigt som stressen på provet begränsas. Genom att använda neurala nätverk för att upptäcka subtila föregångare till händelser av intresse, anpassar EDA inhämtningsparametrarna – såsom bildhastighet eller mätlängd – som svar.
"Ett intelligent mikroskop är ungefär som en självkörande bil. Den behöver bearbeta vissa typer av information, subtila mönster som den sedan reagerar på genom att ändra sitt beteende”, förklarar rektor. Suliana Manley i ett pressmeddelande. "Genom att använda ett neuralt nätverk kan vi upptäcka mycket mer subtila händelser och använda dem för att driva förändringar i förvärvshastighet."
EDA-ramverket, beskrivet i Naturmetoder, består av en återkopplingsslinga mellan en livebildström och mikroskopkontrollerna. Forskarna använde programvaran Micro-Manager för att fånga bilder från mikroskopet och ett neuralt nätverk tränat på märkta data för att analysera dem. För varje bild fungerar nätverksutgången som en beslutsparameter för att växla mellan långsam och snabb avbildning.
Händelseigenkänning
För att demonstrera sin nya teknik integrerade Manley och kollegor EDA i ett omedelbart strukturerat belysningsmikroskop och använde det för att fånga superupplösta time-lapse-filmer av mitokondriella och bakteriella divisioner.
Mitokondriell delning är oförutsägbar och inträffar vanligtvis en gång med några minuters mellanrum och varar i tiotals sekunder. För att förutsäga början av delningen tränade teamet det neurala nätverket för att upptäcka förträngningar, en förändring i mitokondriell form som leder till delning, kombinerat med närvaron av ett protein som kallas DRP1 som krävs för spontana delningar.
Det neurala nätverket matar ut en värmekarta över "händelsepoäng", med högre värden (när både förträngningar och DRP1-nivåer är höga) som indikerar platser i bilden där det är mer sannolikt att delning inträffar. När händelsepoängen överstiger ett tröskelvärde ökar bildhastigheten för att fånga uppdelningshändelserna i detalj. När poängen minskar till en andra tröskel, växlar mikroskopet till låghastighetsavbildning för att undvika att utsätta provet för överdrivet ljus.
Forskarna utförde EDA på celler som uttrycker mitokondrierriktade fluorescerande etiketter. Under varje EDA-mätning kände nätverket igen prekursorer till bakteriedelning nio gånger i genomsnitt. Detta växlade bildhastigheten från långsam (0.2 bildrutor/s) till snabb (3.8 bildrutor/s) under i genomsnitt 10 s, vilket resulterade i snabb bildåtergivning för 18 % av bildrutorna. De noterar att många sajter samlade DRP1 men ledde inte till splittring. Dessa webbplatser utlöste inte nätverket, vilket visar dess förmåga att diskriminera händelser av intresse.
Som jämförelse samlade teamet också in bilder med konstant långsamma och snabba hastigheter. EDA orsakade mindre provfotoblekning än fasthastighets snabb avbildning, vilket möjliggör längre observationer av varje prov och ökade oddsen för att fånga sällsynta mitokondriedelningshändelser. I vissa fall återhämtade sig provet från fotoblekning under de långsamma avbildningsfaserna, vilket möjliggjorde en högre kumulativ ljusdos.
Medan blekning var högre med EDA än för konstant långsam bildbehandling nådde många EDA-sessioner 10 minuter utan försämring av provets hälsa. Forskarna fann också att EDA bättre löste förträngningarna som föregick divisionen, såväl som progressionen av membrantillstånd som ledde till fission, som fångades av snabba bilder.
"Potentialen med intelligent mikroskopi inkluderar att mäta vad standardförvärv skulle missa," förklarar Manley. "Vi fångar fler händelser, mäter mindre förträngningar och kan följa varje division mer i detalj."
Detekterar bakteriedelning
Därefter använde forskarna EDA för att studera celldelning i bakterierna C. crescentus. Den bakteriella cellcykeln sker på en tidsskala av tiotals minuter, vilket skapar distinkta utmaningar för mikroskopi av levande celler. De samlade in data med en långsam bildhastighet på 6.7 bilder/h, en snabb bildhastighet på 20 bilder/timme eller en variabel hastighet omkopplad av EDA.
Teamet fann att händelsedetekteringsnätverket som utvecklats för mitokondriella sammandragningar kunde känna igen de sista stadierna av bakteriell delning utan ytterligare träning - troligen på grund av likheter i sammandragningsform och närvaron av en funktionellt liknande molekylär markör.
Förbättrad mikroskopiteknik ser levande celler med sju gånger mer känslighet
Återigen minskade EDA fotoblekning jämfört med konstant snabb avbildning och mätte förträngningar med betydligt mindre medeldiametrar än med konstant långsam avbildning. EDA möjliggjorde avbildning av hela cellcykeln och gav detaljer om bakteriell celldelning som är svåra att fånga med en fast bildhastighet.
Manley berättar Fysikvärlden att teamet också planerar att träna neurala nätverk för att upptäcka olika typer av händelser och använda dessa för att framkalla olika hårdvarusvar. "Till exempel, vi föreställer oss att utnyttja optogenetiska störningar för att modulera transkription vid viktiga ögonblick i celldifferentiering," förklarar hon. "Vi tänker också på att använda händelsedetektering som ett sätt att komprimera data, välja för lagring eller analys av de bitar av data som är mest relevanta för en viss studie."
- För att göra det möjligt för forskare att implementera EDA på en mängd olika mikroskop, tillhandahåller teamet kontrollramverket som ett plug-in med öppen källkod för programvaran Micro-Manager.
