Genişletme mikroskobu, geleneksel bir mikroskopla nanogörüntülemeyi mümkün kılar

Genişleme mikroskobu, geleneksel bir kırınımla sınırlı floresan mikroskobu kullanarak nano ölçekli görüntüleme sağlayan biyolojik bir görüntüleme tekniğidir. Numuneleri suda şişen bir hidrojele gömerek ve ardından jeli genişleterek çalışır. Bu, biyomolekülleri fiziksel olarak birbirinden uzağa genişletir ve daha önce yalnızca pahalı yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri kullanılarak elde edilebilen bir çözünürlükte sorgulanmalarını sağlar.

Bununla birlikte, mevcut genişleme mikroskobu protokolleri, yaygın kullanım için optimize edilmemiştir. Numuneler, belirli biyomolekülleri ve etiketleri hidrojele bağlamak için özel sabitleme ajanları ile işlenmelidir. Ek olarak, çoğu yaklaşım, 70 nm kırınımla sınırlı objektif merceğe sahip geleneksel bir optik mikroskopta etkili çözünürlüğü yaklaşık 280 nm ile sınırlayarak, yalnızca kabaca dört kat doku genişlemesi elde etti.

Bu eksiklikleri gidermek için bir ekip Carnegie Mellon University Magnify adlı yeni bir genişleme mikroskobu stratejisi geliştirdi. Protokol, açıklanan Nature Biotechnology, ayrı bir sabitleme adımı gerektirmeden bir biyomolekül spektrumunu koruyan, mekanik olarak sağlam yeni bir hidrojel kullanır.

Magnify, numuneleri 11 kata kadar genişleterek, geleneksel bir mikroskop kullanarak hücrelerin ve dokuların yaklaşık 25 nm'lik etkili bir çözünürlükle görüntülenmesini sağlar. Süper çözünürlüklü optik dalgalanma görüntüleme (SOFI, hesaplamalı bir son işleme yöntemi) ile birleştirildiğinde, yaklaşık 15 nm'lik etkili bir çözünürlüğe ulaştı.

Önceki genişleme mikroskobu protokolleri de dokuları bir arada tutan birçok biyomolekülün ortadan kaldırılmasını gerektiriyordu. Kıdemli yazar, "Hücreleri gerçekten genişletilebilir hale getirmek için, proteinleri sindirmek için enzimler kullanmanız gerekir, bu nedenle sonunda, ilgilenilen proteinin yerini gösteren etiketlere sahip boş bir jeliniz oldu" diye açıklıyor kıdemli yazar. Yongxin Zhao bir basın açıklaması yaptı.

"Magnify'ın ana satış noktalarından biri, proteinler, nükleik asitler ve karbonhidratlar dahil olmak üzere dokunun biyomoleküllerini genişletilmiş numune içinde tutmaya yönelik evrensel stratejidir. Moleküller bozulmadan tutulur ve tek bir numunede birden çok biyomolekül türü etiketlenebilir," diye ekliyor Zhao.

Geniş uygulamalar

Zhao ve meslektaşları Magnify'ı çok çeşitli doku tiplerine uyguladılar. Örneğin, toplam protein içeriği için boyanan 11 kat genişletilmiş bir fare beyni bölümünün görüntülenmesi, beyindeki bireysel sinapsların nanoskopik mimarisinin görselleştirilmesini sağladı. Magnify, ×18 objektif lens (yaklaşık 60 nm kırınım sınırı) kullanarak yaklaşık 200 nm'lik etkili bir çözme gücü gösterdi.

Araştırmacılar, Magnify protokolünün çeşitli doku tiplerinde elde ettiği düşük distorsiyonu, SOFI ön-genişletme ve konfokal mikroskopi-genişletme kullanarak doğruladılar. Makroskobik veya alt kırınım seviyelerinde hücre çekirdeklerinin ve protein işaretlerinin genişleme öncesi ve sonrası görüntüleri arasında önemli bir morfolojik değişiklik bulamadılar.

Ekip ayrıca Magnify'ı, en önemli biyopsi hazırlıkları arasında yer alan, ancak mevcut protokollerle genişletilmesi zor olan bir dizi formalinle sabitlenmiş parafine gömülmüş numune üzerinde test etti. Buna böbrek, meme, beyin ve kolondan alınan doku kesitleri ve bunlara karşılık gelen tümörler dahildir. Magnify, doku tipine bağlı olarak numuneleri suda yaklaşık 8.00–10.77 kat genişletebilir.

Temel hedeflerden biri, Magnify'ı geniş bir doku örneği yelpazesi için uygun hale getirmek ve yeni protokolü benimsemek isteyen araştırmacılar tarafından alımını kolaylaştırmaktı. "Farklı doku tipleri, sabitleme yöntemleri ve hatta korunan ve saklanan dokularla çalışır" diyor ortak yazar. Brendan Gallagher. “Magnify ile deneyleri tamamen yeniden tasarlamanız gerekmediği için çok esnektir; zaten sahip olduklarınla ​​çalışacaktır.”

Çözünürlüğü artırma

Araştırmacılar, Magnify'ı SOFI ile eşleştirerek mümkün olan etkili çözünürlükteki daha fazla artışı göstermek için insan akciğer organoidlerini, özellikle hava yolundaki mukusu temizleme işlevi gören kirpikleri görüntülemek için kombinasyonu kullandılar. 200 nm çapında ve sadece birkaç mikrometre uzunluğunda olan bu yapılar genellikle elektron mikroskobu (EM) gibi teknolojiler kullanılmadan görülemeyecek kadar küçüktür.

Magnify–SOFI, daha önce EM tarafından dokuz demet mikrotübül içerdiği gösterilen dış halka da dahil olmak üzere kirpikler ve bazal cisimlerin içi boş yapısını tamamen çözebilir. Araştırmacılar, etkili çözünürlüğü yaklaşık 14-17 nm olarak tahmin ettiler (280 nm kırınımla sınırlı bir objektif lens kullanarak). Genetik mutasyonlara sahip akciğer hücrelerindeki kirpiklerdeki kusurları da görselleştirebildiler.

Süper çözünürlüklü mikroskopi, koronavirüs kopyalayan makineleri ortaya koyuyor

Ortak yazar, "En yeni Magnify teknikleriyle, bu akciğer dokularını genişletebilir ve sıradan bir mikroskopla bile hareketli kirpiklerin ince yapısını bir miktar görmeye başlayabiliriz ve bu, hem temel hem de klinik araştırmaları hızlandıracaktır" diyor. Şi Ren.

Ekip, Magnify'ın başarılı gelişimini temel alarak şimdi onu daha da karmaşık doku örneklerini incelemek için kullanıyor. Zhao, "Bu, enfekte dokuların yanı sıra tüm organlar gibi daha büyük örneklerin keşfedilmesini içerir" dedi. Fizik dünyası. "Ayrıca, patolojik insan örneklerini araştırmak ve öğrenme süreçleri ve hastalıklar sırasında beyindeki nano ölçekli değişiklikleri incelemek için Magnify'ı optimize etmeye çalışıyoruz. Bu atılımlarla, bu son derece umut verici çalışma alanından daha fazla keşif beklenebilir.”

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• Plato blok zinciri. Web3 Metaverse Zekası. Bilgi Güçlendirildi. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://physicsworld.com/a/expansion-microscopy-enables-nanoimaging-with-a-conventional-microscope/