Заява місії на домашній сторінці лабораторії Стенфордського університету Сергій Пашка водночас простий і вражаюче амбітний. Його група «прагне зрозуміти правила, які керують молекулярними та клітинними етапами, що лежать в основі складання нервової системи людини, і молекулярних механізмів, які призводять до неврологічних і психіатричних захворювань».
Обраний Paşca шлях до цієї мети використовує передову форму технології стовбурових клітин. По-перше, він генетично перепрограмує клітини шкіри аутистів і пацієнтів із розладами, такими як шизофренія, на універсальні стовбурові клітини; потім він спонукає клітини осідати в більш визначений стан, як нервова тканина в лабораторному посуді. Спостерігаючи за тим, як ці клітини функціонують або виходять з ладу, Пашка, професор психіатрії та поведінкових наук у Стенфорді та директор Інституту нейронаук Ву Цая, отримує уявлення про те, чим відрізняється мозок людей із неврологічними захворюваннями.
У своєму прагненні зробити ці модельні системи більш правдивими, він зробив, здавалося б, фантастичні наукові інновації. У своїй лабораторії в Пало-Альто Пашка створив мініатюрні сферичні тканини або органоїди, які нагадують різні ділянки людського мозку. Він і його колеги зв'язали органоїди головного, спинного мозку і м'язової тканини в «ассемблоїди», які можуть смикатися за командою.
І в нова робота Щойно оголошена сьогодні, команда Пашки показала, що людські органоїди, введені в мозок молодого щура, що розвивається, можуть спонтанно поширюватися та інтегруватися в нейронні схеми тварини — результат, який вказує шлях до дослідницьких моделей людського мозку, які є все більшими. реалістичний, але практичний і етичний для роботи.
Коли Фонд Вілцека з Нью-Йорка присудив Пашку свою премію 2018 року за творчі перспективи в біомедичній науці, вони зробили це тому, що його «зусилля призвели до створення репозиторію культур мозку пацієнтів, які є одними з найбільш реалістичних макетів розвитку мозку, доступних дослідникам сьогодні .”
За словами його докторського радника, Рікардо Дольмеч, президент відділу досліджень і розробок компанії з генної терапії uniQure: «Робота Сергіу підвищує ймовірність того, що одного дня ми зможемо трансплантувати відсутні клітини мозку хворим людям або розробити лабораторні моделі неврологічних або психіатричних захворювань, які ми зможемо використовувати для розробляти ліки».
Ми розмовляли з Пашкою минулого літа через Zoom і телефоном. Інтерв’ю було скорочено та відредаговано для ясності.
Ви завжди хотіли займатися науковими дослідженнями?
Змалку. Так.
Я виріс у Румунії, у маленькому місті в Трансільванії. У дитинстві я побудував лабораторію в підвалі свого сімейного будинку. Я б спробував покращити ріст рослин, додаючи в ґрунт різні хімікати, а потім вимірюючи їхній ефект. Одного разу я додав молекулу на основі міді. Це спричинило зростання однієї з моїх рослин на 20%. Це підключило мене до дослідження.
А сьогодні ви вирощуєте нервові клітини в лабораторії. Як це сталося?
[Сміється.] Це довга історія. Я відвідував школу в роки після повалення диктатури Чаушеску. У той час Румунія страждала від довготривалих наслідків диктатури — ізоляції, відсталості. Наприкінці середньої школи я посіла призове місце на всеукраїнській олімпіаді з хімії. Приз прийшов із вступом до будь-якого румунського університету. Я вибрав медичний університет Юліу Хацієгану в Клуж-Напоці. Ідея полягала в тому, щоб стати лікарем-дослідником. Тоді я думав і досі відчуваю, що світ потребує їх більше.
На жаль, якось на медичному факультеті я виявив, що ресурсів мало: ні грантів, ні реактивів для лабораторних робіт. Але у мене був один дуже відданий професор, і вона витратила 200 євро власних грошей — цілий статок на той час — щоб замовити невеликий набір реактивів із Німеччини. Потім ми цілий рік планували, як це найкраще використати.
І так у мене вперше виникло вивчення розладів мозку. Я розглядав можливість використання цього набору реагентів для перевірки метаболітів у крові пацієнтів із серцево-судинними захворюваннями. Але щоб щось дізнатися, мені потрібно протестувати сотні, можливо, тисячі пацієнтів. Реагентів нам вистачило лише на 50 реакцій!
Одного разу, перебуваючи на уроці статистики, я зрозумів: єдиний спосіб провести дослідження з невеликою когортою пацієнтів — це розглянути хворобу, яка є рідкісною. Я подумав: аутизм.
Аутизм? Це не така вже й рідкість — один із 50 має певну форму.
Ми цього не знали 20 років тому.
Моя ідея полягала в тому, щоб побачити, чи зможемо ми знайти ознаки захворювання в крові дітей з аутизмом. Щоб провести дослідження, мені потрібно було переконати батьків здати невелику кількість крові своїх дітей. Розмова з ними була щемливою. Це відкрило мені очі на величезні страждання, через які пройшли сім’ї. Батьки дивувалися: «Що це стало причиною?»
Усе, що я міг сказати, це: «Нічого не відомо».
Щоб мати можливість запропонувати кращі відповіді, я записався на курс у Бухаресті, який проводить Міжнародна організація дослідження мозку IBRO. Це були американські та британські нейробіологи, які намагалися принести передову науку про мозок до ізольованих країн. Ясність їхніх презентацій і краса нейронаукових відкриттів, які вони описували, мене надзвичайно схвилювали.
На заняттях я познайомився з Джеком Макмеханом, одним із засновників програми нейробіології в Стенфорді. Ми підтримували зв’язок, а пізніше він допоміг мені приїхати до Каліфорнії.
Що сталося з вашим дослідженням метаболітів?
Ми виявили, що деякі пацієнти з аутизмом мали аномалії метаболізму одного вуглецю. Цей шлях, який залежить від фолієвої кислоти та вітамінів групи В, був дещо порушений, і це, ймовірно, було пов’язано з поєднанням генетичних і харчових факторів.
Коли я закінчив медичну школу, я опублікував кілька робіт про аутизм. Джек Макмехан прочитав їх і сказав: «Чому б вам не приїхати до Стенфорда? У мене є колега, зацікавлений у переміщенні своєї лабораторії в цьому напрямку». Це був Рікардо Дольмеч, який через кілька років став керівником відділу нейронаук в Інституті біомедичних досліджень Novartis.
Потрібен був час, щоб отримати фінансування, але зрештою я отримав стипендію IBRO і приїхав до Пало-Альто.
Яким було ваше завдання в лабораторії Dolmetsch?
Створити новий підхід до вивчення людського мозку.
Кілька років тому Шінья Яманака з Університету Каліфорнії, Сан-Франциско та Кіотського університету з’ясував, як взяти клітини шкіри мишей і перепрограмувати їх, щоб вони перетворювалися на індуковані плюрипотентні стовбурові клітини — iPS-клітини. Стовбурові клітини можуть бути введені в усі типи різних клітин, включаючи нейрони, будівельні блоки нервової системи. За це Яманака отримав би Нобелівську премію.
У лабораторії Рікардо я планував знайти способи трансформації клітин iPS людини в нейрони. Ідея полягала в тому, щоб отримати клітини шкіри від дітей з аутизмом, перетворити їх на стовбурові клітини, а потім перетворити їх на нейрони в чашці Петрі. Якщо нам це вдасться, ми сподіваємося подолати бар’єри, які заважали нам повністю зрозуміти, як розвивається нервова система людини. Це був би спосіб з більшою ясністю зрозуміти біологічну основу нервово-психічних захворювань, таких як аутизм, епілепсія та шизофренія.
Що це за бар'єри?
Головна проблема - нестерпна недоступність людського мозку.
Коли в селезінці або печінці щось йде не так, лікарі беруть біопсію та аналізують тканину. Ця практика зробила революцію в медицині. Дослідники змогли взяти клітини пацієнтів, помістити їх у тарілку, визначити несправні механізми та застосувати різні сполуки для їх відновлення. Так вони відкрили нові ліки.
Але, за винятком рідкісних ситуацій, ми не свердлимо череп живої людини, щоб безпосередньо дослідити тканину людського мозку. Окрім медичних ризиків, існують глибокі культурні табу. Ми схильні асоціювати мозок із «нами», тим, ким ми є. Торкаючись безпосередньо мозку, ці методи певним чином сприймаються як втручання в «я».
Згадуючи свої клінічні чергування в медичній школі, я майже відчув заздрість своїм колегам з онкологічного відділення. Революція в молекулярній біології в поєднанні з доступністю ракових тканин, які їх цікавили, означала, що в розробці були нові методи лікування. Наприклад, з лейкемією відбувалися дивовижні речі.
З аутизмом у нас нічого не було. Ми не змогли визначити механізми, які викликали проблеми, оскільки ми не могли безпосередньо вивчити тканину мозку. І навіть якби ми могли, ми б не знали, що шукати.
Хіба ви не можете вивчити тканину людського мозку, отриману під час розтину?
Посмертний мозок мало що говорить вам про електричну активність живих нейронів. Вам потрібно виміряти цю активність, тому що це те, що роблять нейрони в мозку: вони видають електричні сигнали.
Що стосується моделей на тваринах, вони мають обмеження, коли мова йде про дослідження психічних розладів. Людський мозок складніший, ніж у мишей чи навіть макак. Від цих тварин нас відділяють мільйони років еволюції. Ми бачили незліченні приклади препаратів, які були дуже успішними на гризунах, а потім провалилися в клінічних випробуваннях на людях.
Я думав, що ми можемо просунути справу вперед, створивши тканину живого людського мозку самостійно.
Ваша ідея, мабуть, була суперечливою.
О, так. Були люди, які думали, що це не вийде. Вони думали, що при трансформації клітин шкіри ви втратите патофізіологію хвороби, і тоді ми не зможемо відкрити нічого нового.
Проте протягом восьми місяців у нас були функціонуючі людські нейрони зі стовбурових клітин, які почали з’являтися як шкіра пацієнтів із генетичною формою аутизму. Дивлячись на них під мікроскопом, можна побачити, як вони випромінюють сигнали кальцію. Ми кудись йшли.
Як можна створити нейрони?
Клітинне перепрограмування дало нам стовбурові клітини з клітин шкіри. Потім ми спонукали стовбурові клітини диференціюватися в інші типи клітин.
Стовбурові клітини люблять диференціюватися. Вони повинні перетворитися на інші типи клітин. І вони насправді мають високу ймовірність майже за замовчуванням стати нейронами. Вам не потрібно робити стільки, щоб створити нейрони, хоча скерування ними допомагає. Що ви робите, ви насичуєте середовище, в якому зберігаються стовбурові клітини, молекулами, які сприяють трансформації. Іноді ви також забираєте деякі молекули.
Невдовзі ми мали мільйони прекрасних нейронів. Погана новина полягала в тому, що наші нейрони застрягли на дні чашки Петрі в одному клітинному шарі, де після тижнів культури вони відмовилися. Щоб дізнатися, що відбувається з людським мозком, коли він розвивається протягом місяців за місяцями, нам потрібні довготривалі нейрони.
У мене виникла ідея. Я придбав набір пластикового лабораторного посуду, покритого антипригарною речовиною, і ми вирощували в ньому клітини. На диво, гамбіт спрацював! Клітини не могли прилипнути до посуду. Натомість вони плавали в середовищі, зберігаючи їх, і збиралися в маленькі кульки розміром з горошину.
Спочатку ми називали ці плаваючі згустки клітин сфероїдами. Пізніше вони стали відомі як органоїди — щось, що нагадувало певний орган, але ним не було.
Чим клітини в цих кульках відрізнялися від ваших самотніх нейронів?
Вони росли в тривимірному просторі. Вони рухалися і взаємодіяли один з одним. Важливо те, що вони можуть зберігатися в посуді довше.
За відповідних обставин ми могли б зберігати органоїди 900 днів. І це дозволило нам спостерігати щось нове. Наприклад, приблизно через 10-XNUMX місяців клітини стали більше схожими на постнатальні нейрони, ніж на внутрішньоутробні. Здавалося, вони відчували, як плине час, і що це має означати для їхнього розвитку.
Наскільки корисними були органоїди для вашого дослідження?
Дозвольте розповісти вам про експеримент, який ми з ними провели.
Існує генетичне захворювання, яке називається синдромом делеції 22q11.2, яке включає втрату частини 22-ї хромосоми. У хворих у 30 разів підвищується ризик розвитку шизофренії. У них також може розвинутися аутизм або інші нервово-психічні розлади. Ми залучили 15 пацієнтів і 15 здорових осіб із контрольної групи та почали виробляти нейрони, що нагадують кору головного мозку, зі шкіри, яку вони пожертвували. Ми побачили, що нейрони пацієнтів мали аномальні електричні властивості. Вони не могли нормально спілкуватися один з одним.
Зараз шизофренію часто лікують антипсихотичними препаратами. Ми помістили деякі з цих препаратів у тарілку з кортикальними органоїдами, виготовленими з клітин наших пацієнтів, і побачили, що антипсихотичні препарати усувають проблему з електричними властивостями нейронів.
Це означало, що тепер у нас є спосіб перевірити ці препарати в посуді.
Ви говорили про органоїди. Але що таке асамблеїди?
Assembloids — це нова модельна система, яку ми придумали шість-сім років тому. Це тривимірні системи клітинної культури, побудовані принаймні з двох різних типів органоїдів або шляхом комбінування органоїдів з деякими іншими спеціалізованими типами клітин. Зібравши їх разом, ми можемо побачити нові властивості клітин, що виникають внаслідок їхньої тісної взаємодії.
Ви можете поєднати два органоїди, що нагадують різні ділянки мозку, і побачити, як нейрони проектуються один на одного, а потім з’єднуються, щоб утворити схеми. Або ви можете поєднати органоїди з імунними клітинами та поглянути на нейроімунні взаємодії при хворобі.
Наприклад, існує рідкісний тип аутизму, пов’язаний із генетичним розладом під назвою синдром Тімоті. Це викликано однобуквеною мутацією в гені, що кодує кальцієвий канал. Це дозволяє занадто великій кількості кальцію потрапляти в клітини, коли вони отримують електричні сигнали. Це перешкоджає передачі хімічних сигналів у нейронах та інших збудливих клітинах.
Ми взяли клітини шкіри пацієнтів із синдромом Тімоті, зробили асамблеїди, а потім спостерігали, що відбувається в них. Ми могли бачити, що нейрони, вирощені з клітин пацієнтів, рухалися частіше, але вони рухалися на коротші відстані, ніж нейрони здорової контрольної групи. Клітини пацієнтів зрештою відстали у своїй організації.
Мабуть, було хвилююче спостерігати це в реальному часі.
Ви могли це побачити! Ви буквально могли це побачити на власні очі!
У нас був такий барвник, який фарбував кальцій. У той момент, коли кальцій потрапив у клітини, ви могли побачити, як кольори піднімаються та опускаються, вимірюючи, скільки кальцію потрапило всередину клітини. У камерах пацієнтів його було більше.
Ми витратили шість років, щоб з’ясувати, як саме кальцієвий канал викликає дефекти в русі цих специфічних типів нейронів. Мутований канал у пацієнтів впливає на два різні молекулярні шляхи в нейронах. Важливо те, що ми виявили, що вам потрібні два різні препарати для відновлення активності. Ми думаємо, що тепер у нас є основа для того, що в майбутньому може залучити нас до лікування.
Ми б ніколи не змогли цього навчитися без ассемблоїдів, тому що вам потрібно, щоб клітини взаємодіяли в трьох вимірах, щоб це захопити.
У своїй новій статті ви повідомляєте, що ваша лабораторія створила щура, у якого людські нейрони покривають одну третину кори тварини в одній півкулі та глибоко інтегровані в мозок. Навіщо створювати цю модель?
Понад десять років ми готуємо культури в посуді, які повторюють багато аспектів нервової системи людини. Але є обмеження для цих культур: нейрони, які ми створили, не ростуть у таких великих розмірах. Немає ніяких поведінкових результатів, як це було б у справжньому людському мозку. І вони не отримують сенсорних сигналів, які б сформували їхній розвиток — корі головного мозку потрібно отримувати сигнали. Ми намагалися надати значущі зовнішні дані цим людським нейронам.
Тож наступним кроком було вирощування людських нейронів у мозку щура. Ми взяли органоїди та пересадили їх у кору головного мозку цуценяти. Органоїд васкуляризувався щуром і врешті-решт розрісся до однієї третини півкулі кори головного мозку.
Я думав, ти не дуже прихильник тваринних моделей для дослідження людського мозку. Що трапилось?
Я вважаю, що моделі тварин і клітини людини доповнюють один одного. У цьому випадку трансплантація тваринам дозволяє нам інтегрувати нейрони людини в схеми для розуміння цих захворювань і тестування ліків. Це ще один спосіб зрозуміти, як людські нейрони обробляють інформацію в живих ланцюгах.
Таким чином, ці людські нейрони з органоїдів мали шанс вирости в мозку щурів, і вони могли отримувати вхідні та вихідні дані від тварини. Як вони порівнюються з нейронами, які виросли лише всередині органоїдів? І як вони порівнюються з нейронами, що ростуть у нашому власному мозку?
Трансплантовані людські нейрони приблизно в шість разів більші за людські нейрони порівнянного розвитку, які зберігаються в чашці. Вони також є більш зрілими електрофізіологічно, утворюють більше синапсів і знаходяться набагато ближче до нейронів у постнатальному мозку людини.
Чи бачите ви якісь відмінності в поведінці цих щурів, які отримали стільки людських нейронів?
Ні. Немає відмінностей у когнітивних і рухових завданнях, у яких ми тестували щурів. Ми також переконалися, що вони не відчувають судом. Однак щурів можна навчити пов’язувати стимуляцію людських нейронів із отриманням винагороди. Це відкриває безпрецедентні можливості для вивчення розладів людського мозку.
У який момент ваші асембоїди та органоїди повинні мати якісь законні права?
Я думаю, що для культур in vitro це просто кластери клітин. Ми не вважаємо їх мізками. Це стає більш нюансами, коли справа доходить до пересадки тваринам.
Як біоетики ставляться до ваших експериментів?
Ми з ними тісно співпрацюємо. На всьому цьому шляху я брав активну участь в дискусіях з етиками в Стенфорді та за його межами. Усі експерименти, які ми проводимо, ретельно контролюються та обговорюються з етиками. Ми не проводимо експерименти окремо. Експерименти обговорюються перед їх початком і, звичайно, під час їх проведення. Ми поговоримо про наслідки, плюси та мінуси.
Ви коли-небудь думали про Франкенштейн історія?
Я багато думаю про це. Але я думаю, що ця історія не настільки актуальна для сучасної науки. У сучасному світі можна розробити етичні технології. Багато що пов’язано з мотивами дослідника. Моя довгострокова мета — знайти лікування та, можливо, ліки від цих розладів нервової системи. Це була моя Полярна зірка.
Кілька років тому, перш ніж вона отримала Нобелівську премію за CRISPR, я запитав Дженніфер Дудну, чи не хвилюється вона з приводу можливого зловживання цією технологією редагування генів. Вона відповіла, що її турбує «бажання в деяких регіонах поспішати змінювати людські ембріони». Незабаром після цього амбітний дослідник із Шеньчженя, Китай, оголосив, що використав CRISPR для перегляду генетичного коду двох немовлят. Ви коли-небудь хвилювалися, взявши газету в руки, і виявили, що десь вчений використав вашу роботу для передчасного створення частин людського мозку?
Ні. Однією з речей, яка відрізняє органоїдну роботу від CRISPR, є ресурси, необхідні для експериментів. Щоб редагувати гени за допомогою CRISPR, потрібне лише деяке навчання та невеликі ресурси. Це можливо зробити на вашій кухні! Те, що ми робимо, вимагає набагато більше часу та грошей. Підтримувати клітини живими протягом 900 днів досить дорого і вимагає спеціальної підготовки та обладнання. Один цей факт дає нам певний простір для обробки наших відкриттів та їхніх наслідків.
Є кілька місць з інфраструктурою та досвідом, необхідними для цього. Ми намагаємося відтворити розвиток людського мозку, що займає дуже багато часу. Розкриття його прихованої техніки займає ще більше часу. Я працюю над цим щодня протягом останніх 15 років.
Наскільки ви близькі до деяких рішень?
Я сподіваюся, але я не хочу бути нереалістичним. Нам, звичайно, краще, ніж 15 років тому. Тепер у нас є довгі списки генів, пов’язаних з аутизмом, і ми маємо новий інструмент для їх вивчення. Але нам все ще потрібно зрозуміти, як ці мутовані гени викликають у мозку проблеми, щоб ми могли створити ефективні ліки.
Ваша історія починається в Румунії 20 років тому, коли ви не знали, що сказати батькам дітей з аутизмом. Якби ви зараз повернулися до цієї країни, що б ви сказали?
Все, що я можу чесно сказати, це те, що я сподіваюся. Ми ще далекі від того, щоб знайти ліки. З іншого боку, останніми роками відбувся величезний прорив у лікуванні інших, здавалося б, нерозв’язних захворювань. Це дає мені величезну надію.
