Deklaracja misji na stronie głównej laboratorium Uniwersytetu Stanforda Sergiu Pasca jest jednocześnie prosty i spektakularnie ambitny. Jego grupa „stara się zrozumieć zasady rządzące etapami molekularnymi i komórkowymi leżącymi u podstaw budowy ludzkiego układu nerwowego i mechanizmów molekularnych prowadzących do chorób neurologicznych i psychiatrycznych”.
Wybrana przez Paşca droga do tego celu wykorzystuje zaawansowaną formę technologii komórek macierzystych. Po pierwsze, genetycznie przeprogramowuje komórki skóry osób autystycznych i pacjentów z zaburzeniami takimi jak schizofrenia, aby stały się wszechstronnymi komórkami macierzystymi; następnie indukuje komórki do osiedlenia się w bardziej zdefiniowanym stanie jako tkanka nerwowa w naczyniu laboratoryjnym. Obserwując, jak te komórki funkcjonują lub działają nieprawidłowo, Paşca, profesor psychiatrii i nauk behawioralnych w Stanford oraz dyrektor Instytutu Neuronauki Wu Tsai, zyskuje wgląd w to, co sprawia, że mózgi osób cierpiących na schorzenia neurologiczne są inne.
W swoim dążeniu do urzeczywistnienia tych systemów modelowych, dokonał pozornie fantastycznych innowacji naukowych. W swoim laboratorium Palo Alto Paşca stworzył miniaturowe kuliste tkanki, czyli organoidy, które przypominają różne obszary ludzkiego mózgu. On i jego koledzy połączyli organoidy mózgu, rdzenia kręgowego i tkanki mięśniowej w „assembloidy”, które mogą drgać na polecenie.
A w nowa praca ogłoszony dzisiaj, zespół Paşca wykazał, że ludzkie organoidy wprowadzone do rozwijającego się mózgu młodego szczura mogą spontanicznie rozprzestrzenić się i zintegrować z obwodami neuronalnymi zwierzęcia — wynik, który wskazuje drogę do coraz liczniejszych modeli badawczych ludzkiego mózgu. realistyczne, ale praktyczne i etyczne do pracy.
Kiedy Vilcek Foundation z Nowego Jorku przyznała Paşca nagrodę 2018 za twórczą obietnicę w dziedzinie nauk biomedycznych, zrobili to, ponieważ jego „wysiłek doprowadził do stworzenia repozytorium kultur mózgu pochodzących od pacjentów, które są jednymi z najbardziej realistycznych modeli rozwoju mózgu dostępnych obecnie naukowcom ”.
Według jego doradcy habilitowanego, Ricardo Dolmetscha, prezes ds. badań i rozwoju w firmie zajmującej się terapią genową uniQure: „Prace Sergiu stwarzają możliwość, że pewnego dnia będziemy w stanie przeszczepić brakujące komórki mózgowe osobom chorym lub opracować modele laboratoryjne chorób neurologicznych lub psychiatrycznych, które będziemy mogli wykorzystać do opracowywać leki”.
Zeszłego lata rozmawialiśmy z Paşcą przez Zoom i telefon. Wywiady zostały skondensowane i zredagowane dla jasności.
Czy zawsze chciałeś prowadzić badania naukowe?
Od młodości. TAk.
Dorastałem w Rumunii, w małym mieście w Transylwanii. Jako dziecko zbudowałem laboratorium w piwnicy domu mojej rodziny. Próbowałem poprawić wzrost roślin, dodając do gleby różne chemikalia, a następnie mierząc ich działanie. Kiedyś dodałem cząsteczkę opartą na miedzi. To spowodowało wzrost jednej z moich roślin o 20%. To zachęciło mnie do badań.
A dzisiaj hodujesz komórki nerwowe w laboratorium. Jak do tego doszło?
[Śmiech.] To długa historia. Chodziłem do szkoły w latach po obaleniu dyktatury Ceauşescu. W tym czasie Rumunia cierpiała z powodu długotrwałych skutków dyktatury — izolacji, niedorozwoju. Pod koniec liceum zdobyłam nagrodę w ogólnopolskim konkursie z chemii. Nagroda przyszła wraz z przyjęciem na dowolną rumuńską uczelnię. Wybrałem Uniwersytet Medyczny Iuliu Haţieganu w Klużu-Napoce. Pomysł polegał na tym, aby zostać lekarzem-badaczem. Myślałem wtedy i nadal czuję, że świat potrzebuje ich więcej.
Niestety, kiedy byłem już w szkole medycznej, odkryłem, że było niewiele zasobów: żadnych grantów, żadnych odczynników do pracy laboratoryjnej. Ale miałem jednego bardzo oddanego profesora, a ona wydała 200 euro z własnych pieniędzy — wówczas fortunę — na zamówienie małego zestawu odczynników z Niemiec. Następnie planowaliśmy na rok, jak najlepiej go wykorzystać.
I tak po raz pierwszy pojawiło się dla mnie studiowanie zaburzeń mózgu. Rozważałem użycie tego zestawu odczynników do badania metabolitów we krwi pacjentów z chorobami układu krążenia. Ale żeby się czegoś nauczyć, musiałbym przetestować setki, może tysiące pacjentów. Odczynników wystarczyło na 50 reakcji!
Pewnego dnia, podczas zajęć ze statystyki, dotarło do mnie, że jedynym sposobem przeprowadzenia badania na małej grupie pacjentów byłoby przyjrzenie się rzadkiej chorobie. Pomyślałem: autyzm.
Autyzm? To nie jest takie rzadkie — jeden na 50 ma jakąś jego formę.
Nie wiedzieliśmy tego 20 lat temu.
Moim pomysłem było sprawdzenie, czy możemy znaleźć sygnatury choroby we krwi dzieci z autyzmem. Aby przeprowadzić badanie, musiałam przekonać rodziców do oddania niewielkich ilości krwi swoich dzieci. Rozmowa z nimi łamała serce. To otworzyło mi oczy na ogromne cierpienie, przez które przechodziły rodziny. Rodzice zastanawiali się: „Co to spowodowało?”
Mogłem tylko powiedzieć: „Nic nie jest znane”.
Aby móc oferować lepsze odpowiedzi, zapisałam się na kurs w Bukareszcie, oferowany przez Międzynarodową Organizację Badań Mózgu, IBRO. Byli to amerykańscy i brytyjscy neuronaukowcy próbujący wprowadzić zaawansowaną naukę mózgu do odizolowanych krajów. Przejrzystość ich prezentacji i piękno opisywanych przez nich neuronaukowych odkryć niezmiernie mnie podekscytowały.
Na zajęciach poznałem Jacka McMahana, jednego z założycieli programu neurobiologii na Stanford. Pozostaliśmy w kontakcie, a później pomógł mi przyjechać do Kalifornii.
Co się stało z twoim badaniem metabolitów?
Odkryliśmy, że niektórzy pacjenci z autyzmem mieli nieprawidłowości w metabolizmie jednowęglowym. Ten szlak, który jest zależny od kwasu foliowego i witamin z grupy B, został nieco zaburzony, co prawdopodobnie było związane z kombinacją czynników genetycznych i żywieniowych.
Zanim skończyłem studia medyczne, opublikowałem kilka artykułów na temat autyzmu. Jack McMahan przeczytał je i powiedział: „Dlaczego nie przyjedziesz do Stanford? Mam kolegę zainteresowanego przeniesieniem swojego laboratorium w tym kierunku”. Był to Ricardo Dolmetsch, który kilka lat później został globalnym szefem neuronauki w Novartis Institutes for Biomedical Research.
Trochę zajęło mi zdobycie funduszy, ale w końcu dostałem stypendium IBRO i trafiłem do Palo Alto.
Jakie było twoje zadanie w laboratorium Dolmetsch?
Aby stworzyć nowe podejście do poznawania ludzkiego mózgu.
Kilka lat wcześniej Shinya Yamanaka z Uniwersytetu Kalifornijskiego, San Francisco i Uniwersytetu w Kioto wymyślił, jak pobierać komórki skóry od myszy i przeprogramowywać je, aby zamieniały się z powrotem w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste — komórki iPS. Komórki macierzyste można namawiać na różne rodzaje komórek, w tym neurony, budulec układu nerwowego. Yamanaka dostałby za to Nagrodę Nobla.
W laboratorium Ricardo planowałem znaleźć sposób na przekształcenie ludzkich komórek iPS w neurony. Pomysł polegał na pozyskaniu komórek skóry od dzieci z autyzmem, przekształceniu ich z powrotem w komórki macierzyste, a następnie skierowaniu ich na neurony na szalce Petriego. Jeśli nam się udało, mieliśmy nadzieję przeskoczyć bariery, które uniemożliwiały nam pełne zrozumienie rozwoju ludzkiego układu nerwowego. Byłby to sposób na lepsze zrozumienie biologicznych podstaw chorób neuropsychiatrycznych, takich jak autyzm, epilepsja i schizofrenia.
Jakie są te bariery?
Głównym problemem jest nieznośna niedostępność ludzkiego mózgu.
Kiedy coś pójdzie nie tak w śledzionie lub wątrobie, lekarze wykonują biopsję i analizują tkankę. Ta praktyka zrewolucjonizowała medycynę. Badaczom udało się pobrać komórki pacjentów, umieścić je w naczyniu, zidentyfikować nieprawidłowo działające mechanizmy i zastosować różne związki, aby je przywrócić. W ten sposób odkryli nowe leki.
Ale z wyjątkiem rzadkich sytuacji nie przewiercamy czaszki żywej osoby, aby bezpośrednio zbadać ludzką tkankę mózgową. Oprócz zagrożeń medycznych istnieją głębokie kulturowe tabu. Mamy tendencję do kojarzenia mózgu z „nami”, z tym, kim jesteśmy. Dotykając bezpośrednio mózgu, metody te są w pewnym sensie postrzegane jako ingerujące w „ja”.
Wracając myślami do moich rotacji klinicznych na studiach medycznych, prawie zazdrościłam moim kolegom na oddziale onkologicznym. Rewolucja biologii molekularnej w połączeniu z dostępnością interesujących ich tkanek nowotworowych oznaczała, że w przygotowaniu są nowe metody leczenia. Na przykład z białaczką działy się niesamowite rzeczy.
Z autyzmem nie mieliśmy nic. Nie mogliśmy zidentyfikować mechanizmów, które powodowały problemy, ponieważ nie mogliśmy bezpośrednio badać tkanki mózgowej. A nawet gdybyśmy mogli, nie wiedzielibyśmy, czego szukać.
Czy nie moglibyście zbadać ludzkiej tkanki mózgowej uzyskanej z autopsji?
Mózg pośmiertny niewiele mówi o elektrycznej aktywności żywych neuronów. Musisz zmierzyć tę aktywność, ponieważ to właśnie robią neurony w mózgu: wysyłają sygnały elektryczne.
Jeśli chodzi o modele zwierzęce, mają one ograniczenia, jeśli chodzi o badania zaburzeń psychicznych. Ludzki mózg jest bardziej skomplikowany niż mózg myszy, a nawet makaka. Miliony lat ewolucji oddzielają nas od tych zwierząt. Widzieliśmy niezliczone przykłady leków, które okazały się bardzo skuteczne u gryzoni, a następnie zawiodły w badaniach klinicznych na ludziach.
Pomyślałem, że możemy posunąć się do przodu, jeśli sami stworzymy żywą ludzką tkankę mózgową.
Twój pomysł musiał być kontrowersyjny.
O tak. Byli ludzie, którzy myśleli, że to nie zadziała. Myśleli, że przekształcając komórki skóry, stracisz patofizjologię choroby, a wtedy nie będziemy w stanie odkryć niczego nowego.
Jednak w ciągu ośmiu miesięcy mieliśmy funkcjonujące ludzkie neurony z komórek macierzystych, które początkowo były skórą pacjentów z genetyczną postacią autyzmu. Patrząc na nie pod mikroskopem, można było zobaczyć, jak emitują sygnały wapniowe. Dokądś dochodziliśmy.
Jak się zajmuje tworzenie neuronów?
Przeprogramowanie komórkowe dało nam komórki macierzyste z komórek skóry. Następnie nakłoniliśmy komórki macierzyste do różnicowania się w inne typy komórek.
Komórki macierzyste uwielbiają się różnicować. Muszą zmienić się w inne typy komórek. I faktycznie mają duże prawdopodobieństwo, że staną się neuronami prawie domyślnie. Nie musisz tak wiele robić, aby wytworzyć neurony, chociaż prowadzenie ich pomaga. To, co robisz, to wzbogacanie podłoża, w którym trzymane są komórki macierzyste, molekułami, które promują transformację. Czasami zabierasz też trochę molekuł.
Wkrótce mieliśmy miliony pięknych neuronów. Zła wiadomość była taka, że nasze neurony przykleiły się do dna szalki Petriego w pojedynczej warstwie komórek, gdzie po tygodniach hodowli uległy. Gdybyśmy mieli odkryć, co dzieje się z ludzkim mózgiem, gdy rozwija się przez wiele miesięcy, potrzebowalibyśmy trwalszych neuronów.
Miałem pomysł. Kupiłem zestaw plastikowych naczyń laboratoryjnych pokrytych substancją zapobiegającą przywieraniu i hodowaliśmy w nich komórki. O dziwo, gambit zadziałał! Komórki nie mogły przykleić się do naczynia. Zamiast tego unosiły się w podłożu, utrzymując je i gromadzą się w małe kulki wielkości grochu.
Na początku nazwaliśmy te pływające kępy komórek sferoidami. Później stały się znane jako organoidy — coś, co przypominało określony organ, ale nim nie było.
Czym różniły się komórki w tych kulkach od twoich samotnych neuronów?
Rosły w trójwymiarowej przestrzeni. Poruszali się i wchodzili ze sobą w interakcje. Co ważne, można je przechowywać w naczyniu przez dłuższy czas.
W odpowiednich okolicznościach moglibyśmy przechowywać organoidy przez 900 dni. A to pozwoliło nam obserwować nowe rzeczy. Na przykład po około dziewięciu lub dziesięciu miesiącach komórki bardziej przypominały neurony poporodowe niż prenatalne. Wydawali się mieć poczucie upływu czasu i tego, co to powinno oznaczać dla ich rozwoju.
Jak przydatne były organoidy do twoich badań?
Opowiem wam o eksperymencie, który z nimi przeprowadziliśmy.
Istnieje choroba genetyczna zwana zespołem delecji 22q11.2, która wiąże się z utratą części 22. chromosomu. Pacjenci mają 30-krotny wzrost ryzyka schizofrenii. Mogą również rozwinąć autyzm lub inne zaburzenia neuropsychiatryczne. Zrekrutowaliśmy 15 pacjentów i 15 zdrowych osób z grupy kontrolnej i zaczęliśmy wytwarzać neurony przypominające korę mózgową ze skóry, którą podarowali. Widzieliśmy, że neurony pacjentów miały nieprawidłowe właściwości elektryczne. Nie mogli się ze sobą właściwie porozumieć.
Obecnie schizofrenię często leczy się lekami przeciwpsychotycznymi. Umieściliśmy niektóre z tych leków w naczyniu z organoidami korowymi wytworzonymi z komórek naszych pacjentów i zobaczyliśmy, że leki przeciwpsychotyczne odwróciły problem z właściwościami elektrycznymi neuronów.
Oznaczało to, że mamy teraz sposób na testowanie tych leków w naczyniu.
Mówiłeś o organoidach. Ale czym są assembloidy?
Assembloidy to nowy system modelowy, który wymyśliliśmy sześć do siedmiu lat temu. Są to trójwymiarowe systemy hodowli komórkowych zbudowane z co najmniej dwóch różnych typów organoidów lub poprzez połączenie organoidów z niektórymi innymi wyspecjalizowanymi typami komórek. Łącząc je razem, możemy zobaczyć nowe właściwości komórek wynikające z ich bliskich interakcji.
Możesz połączyć ze sobą dwa organoidy przypominające różne regiony mózgu i zobaczyć, jak neurony rzutują na siebie, a następnie łączą się, tworząc obwody. Możesz też połączyć organoidy z komórkami odpornościowymi i przyjrzeć się interakcjom neuroimmunologicznym w chorobie.
Na przykład istnieje rzadki typ autyzmu związany z zaburzeniem genetycznym zwanym zespołem Timothy'ego. Jest to spowodowane jednoliterową mutacją w genie kodującym kanał wapniowy. Pozwala na przedostanie się zbyt dużej ilości wapnia do komórek, gdy odbierają one sygnały elektryczne. To zakłóca przekazywanie sygnałów chemicznych w neuronach i innych pobudliwych komórkach.
Pobraliśmy komórki skóry od pacjentów z zespołem Timothy'ego, wykonaliśmy assembloidy, a następnie obserwowaliśmy, co się w nich dzieje. Mogliśmy zobaczyć, że neurony wyhodowane z komórek pacjentów poruszały się częściej, ale poruszały się na krótsze odległości niż neurony ze zdrowej grupy kontrolnej. Komórki pacjentów ostatecznie zostały opóźnione w swojej organizacji.
To musiało być ekscytujące być świadkiem tego w czasie rzeczywistym.
Możesz to zobaczyć! Można to było dosłownie zobaczyć na własne oczy!
Mieliśmy barwnik, który barwił wapń. W momencie, gdy wapń dostał się do komórek, można było zobaczyć, jak kolory wznoszą się i opadają, mierząc, ile wapnia dostało się do wnętrza komórki. W celach pacjentów było go więcej.
Spędziliśmy sześć lat, zastanawiając się dokładnie, w jaki sposób kanał wapniowy powoduje defekty w ruchu tych specyficznych typów neuronów. Zmutowany kanał u pacjentów wpływa na dwa różne szlaki molekularne w neuronach. Co ważne, odkryliśmy, że do przywrócenia aktywności potrzebne są dwa różne leki. Myślimy, że mamy teraz podstawy do tego, co może w przyszłości skłonić nas do leczenia.
Bez assembloidów nigdy nie bylibyśmy w stanie się tego nauczyć, ponieważ aby to uchwycić, komórki potrzebują interakcji w trzech wymiarach.
W swoim nowym artykule ogłaszasz, że twoje laboratorium stworzyło szczura, u którego ludzkie neurony pokrywają jedną trzecią kory zwierzęcia na jednej półkuli i głęboko integrują się z mózgiem. Po co tworzyć ten model?
Od ponad dekady tworzymy kultury w naczyniu, które rekapituluje wiele aspektów ludzkiego układu nerwowego. Ale te kultury mają pewne ograniczenia: neurony, które stworzyliśmy, nie rosną tak duże. Nie ma wyników behawioralnych, jakie byłyby w prawdziwym ludzkim mózgu. I nie otrzymują bodźców sensorycznych, które kształtowałyby ich rozwój — kora musi odbierać sygnały. Staramy się zapewnić tym ludzkim neuronom jakiś znaczący zewnętrzny sygnał wejściowy.
Następnym krokiem było więc wyhodowanie ludzkich neuronów w mózgu szczura. Pobraliśmy organoidy i przeszczepiliśmy je do kory mózgowej szczenięcia szczura. Organoid został unaczyniony przez szczura i ostatecznie rozrósł się, by pokryć jedną trzecią jego półkuli korowej mózgu.
Myślałem, że nie jesteś fanem modeli zwierzęcych do badań nad ludzkim mózgiem. Co się stało?
Myślę, że modele zwierzęce i ludzkie modele komórkowe uzupełniają się. W tym przypadku przeszczepienie zwierzętom pozwala nam zintegrować ludzkie neurony w obwody w celu zrozumienia tych chorób i testowania leków. To także inny sposób na zrozumienie, w jaki sposób ludzkie neurony przetwarzają informacje w żywych obwodach.
Więc te ludzkie neurony z organoidów miały szansę wyrosnąć w mózgach szczura i były w stanie uzyskać dane wejściowe i wyjściowe od zwierzęcia. Jak można je porównać z neuronami, które wyrosły tylko w organoidach? A jak mają się one do neuronów rosnących w naszych mózgach?
Przeszczepione ludzkie neurony są około sześć razy większe niż ludzkie neurony o porównywalnym rozwoju utrzymywane w naczyniu. Są również bardziej dojrzałe elektrofizjologicznie, tworzą więcej synaps i są znacznie bliżej neuronów w ludzkim mózgu po urodzeniu.
Czy widzisz jakieś różnice behawioralne u tych szczurów, które nabyły tak wiele ludzkich neuronów?
Nie. Nie ma różnic w zadaniach poznawczych i motorycznych, w których testowaliśmy szczury. Sprawdziliśmy również i nie doświadczają napadów. Szczury można jednak nauczyć kojarzyć stymulację ludzkich neuronów z dostarczaniem nagrody. Daje to niespotykane dotąd możliwości badania zaburzeń ludzkiego mózgu.
W którym momencie twoje assembloidy i organoidy powinny mieć jakieś prawa?
Myślę, że dla kultur in vitro są to po prostu skupiska komórek. Nie uważamy ich za mózgi. Staje się bardziej zniuansowany, jeśli chodzi o przesadzanie do zwierząt.
Jak bioetycy sądzą o twoich eksperymentach?
Ściśle z nimi współpracujemy. Na całej tej drodze aktywnie uczestniczyłem w dyskusjach z etykami ze Stanford i nie tylko. Wszystkie przeprowadzane przez nas eksperymenty są ściśle monitorowane i omawiane z etykami. Nie przeprowadzamy eksperymentów w odosobnieniu. Eksperymenty są omawiane przed ich podjęciem, a już na pewno w trakcie ich trwania. Porozmawiamy o implikacjach, zaletach i wadach.
Czy kiedykolwiek myślałeś o tym Frankenstein fabuła?
Dużo o tym myślę. Ale myślę, że ta historia nie jest aż tak istotna dla dzisiejszej nauki. W dzisiejszym świecie można rozwijać technologie, które są etyczne. Wiele ma związek z motywem badacza. Moim długoterminowym celem jest znalezienie leczenia i być może lekarstwa na te zaburzenia neurorozwojowe. To była moja Gwiazda Polarna.
Kilka lat temu, zanim otrzymała Nagrodę Nobla za CRISPR, zapytałem Jennifer Doudnę, czy martwi się potencjalnym nadużyciem tej technologii edycji genów. Odpowiedziała, że martwi ją „chęć w niektórych obszarach pospiesznego pospiesznego działania w celu zmiany ludzkich embrionów”. Niedługo potem ambitny badacz z Shenzhen w Chinach ogłosił, że użył CRISPR do zrewidowania kodu genetycznego dwojga ludzkich dzieci. Czy kiedykolwiek martwisz się, że podniesiesz gazetę i odkryjesz, że jakiś naukowiec wykorzystał twoją pracę do przedwczesnego wytworzenia części ludzkiego mózgu?
Nie. Jedną z rzeczy, która odróżnia prace organoidalne od CRISPR, są zasoby potrzebne do eksperymentów. Edycja genów za pomocą CRISPR wymaga tylko pewnego szkolenia i niewielu zasobów. Możesz to zrobić w swojej kuchni! To, co robimy, wymaga dużo więcej czasu i pieniędzy. Utrzymanie komórek przy życiu przez 900 dni jest dość drogie i wymaga specjalistycznego szkolenia i urządzeń. Już sam ten fakt daje nam chwilę wytchnienia, aby przetworzyć nasze odkrycia i ich implikacje.
Niewiele jest miejsc z infrastrukturą i wiedzą potrzebną do tego. Próbujemy odtworzyć rozwój ludzkiego mózgu, co zajmuje bardzo dużo czasu. Odkrycie jego ukrytej inżynierii trwa jeszcze dłużej. Pracuję nad tym codziennie od 15 lat.
Jak blisko jesteś niektórych rozwiązań?
Mam nadzieję, ale nie chcę być nierealistyczny. Na pewno jesteśmy w lepszej sytuacji niż 15 lat temu. Mamy teraz długą listę genów związanych z autyzmem i mamy nowe narzędzie do ich badania. Ale nadal musimy zrozumieć, w jaki sposób te zmutowane geny powodują nieprawidłowe działanie mózgu, abyśmy mogli tworzyć skuteczne leki.
Twoja historia zaczyna się w Rumunii 20 lat temu, kiedy nie wiedziałeś, co powiedzieć rodzicom dzieci z autyzmem. Gdybyś wrócił teraz do tego kraju, co byś powiedział?
Wszystko, co mogę szczerze powiedzieć, to to, że mam nadzieję. Wciąż daleko nam do wyleczenia. Z drugiej strony w ostatnich latach nastąpiły ogromne przełomy w innych pozornie nierozpuszczalnych chorobach. To daje mi ogromną nadzieję.
