Microscopia cu fluorescență a celulelor vii oferă un instrument indispensabil pentru studierea dinamicii sistemelor biologice. Dar multe procese biologice, cum ar fi diviziunea celulară bacteriană și diviziunea mitocondrială, de exemplu, apar sporadic, ceea ce le face dificil de capturat.
Imaginea continuă a unui eșantion la o rată de cadre ridicată ar asigura că atunci când apar astfel de diviziuni, acestea vor fi cu siguranță înregistrate. Dar imagistica cu fluorescență excesivă provoacă fotoalbirea și poate distruge prematur mostrele vii. Între timp, o rată de cadre mai lentă, riscă să lipsească evenimente de interes. Ceea ce este necesar este o modalitate de a prezice când un eveniment este pe cale să se întâmple și apoi de a instrui microscopul să înceapă imagistica de mare viteză.
Cercetători de la Institutul Federal Elvețian de Tehnologie Lausanne (EPFL) au creat tocmai un astfel de sistem. Echipa a dezvoltat un cadru de achiziție bazată pe evenimente (EDA) care automatizează controlul microscopului pentru a vizualiza evenimentele biologice în detaliu, limitând în același timp stresul asupra eșantionului. Folosind rețelele neuronale pentru a detecta precursorii subtili ai evenimentelor de interes, EDA adaptează parametrii de achiziție – cum ar fi viteza imaginii sau durata măsurării – ca răspuns.
„Un microscop inteligent este un fel ca o mașină care se conduce singur. Trebuie să prelucreze anumite tipuri de informații, modele subtile la care apoi răspunde schimbându-și comportamentul”, explică investigatorul principal. Suliana Manley într-o declarație de presă. „Prin utilizarea unei rețele neuronale, putem detecta evenimente mult mai subtile și le putem folosi pentru a determina schimbări în viteza de achiziție.”
Cadrul EDA, descris în Natură Metode, constă într-o buclă de feedback între un flux de imagini live și controalele microscopului. Cercetătorii au folosit software-ul Micro-Manager pentru a captura imagini de la microscop și o rețea neuronală antrenată pe date etichetate pentru a le analiza. Pentru fiecare imagine, ieșirea rețelei acționează ca un parametru de luare a deciziilor pentru a comuta între imaginea lentă și rapidă.
Recunoașterea evenimentului
Pentru a-și demonstra noua tehnică, Manley și colegii au integrat EDA într-un microscop cu iluminare structurată instantanee și l-au folosit pentru a capta filme super-rezolvate în time-lapse ale diviziunilor mitocondriale și bacteriene.
Diviziunea mitocondrială este imprevizibilă, având loc de obicei o dată la câteva minute și durează zeci de secunde. Pentru a prezice debutul diviziunii, echipa a antrenat rețeaua neuronală pentru a detecta constricțiile, o schimbare a formei mitocondriale care duce la diviziune, combinată cu prezența unei proteine numite DRP1, care este necesară pentru diviziunile spontane.
Rețeaua neuronală emite o hartă termică a „scorurilor evenimentelor”, cu valori mai mari (când atât constricțiile, cât și nivelurile DRP1 sunt ridicate) indicând locațiile din imagine în care este mai probabil să apară diviziunea. Odată ce scorul evenimentului depășește o valoare de prag, viteza imaginii crește pentru a surprinde evenimentele de diviziune în detaliu. Odată ce scorul scade la un al doilea prag, microscopul trece la imagini de viteză mică pentru a evita expunerea probei la lumină excesivă.
Cercetătorii au efectuat EDA pe celulele care exprimă etichete fluorescente vizate de mitocondrii. În timpul fiecărei măsurători EDA, rețeaua a recunoscut precursorii diviziunii bacteriene în medie de nouă ori. Aceasta a comutat viteza de imagine de la lentă (0.2 cadre/s) la rapidă (3.8 cadre/s) pentru o medie de 10 s, rezultând o imagine rapidă pentru 18% din cadre. Ei notează că multe site-uri au acumulat DRP1, dar nu au dus la divizare. Aceste site-uri nu au declanșat rețeaua, demonstrând capacitatea acesteia de a discrimina evenimentele de interes.
Pentru comparație, echipa a colectat și imagini la viteze lente și rapide constante. EDA a cauzat mai puțină fotoalbire a probei decât imagistica rapidă cu viteză fixă, permițând observații mai lungi ale fiecărei probe și crescând șansele de a captura evenimente rare de diviziune mitocondrială. În unele cazuri, proba s-a recuperat de la fotoalbire în timpul fazelor lente de imagistică, permițând o doză de lumină cumulată mai mare.
În timp ce albirea a fost mai mare cu EDA decât pentru imagistica lentă constantă, multe sesiuni EDA au ajuns la 10 minute fără degradarea sănătății probei. Cercetătorii au descoperit, de asemenea, că EDA a rezolvat mai bine constricțiile premergătoare diviziunii, precum și progresia stărilor membranei care duc la fisiune, așa cum au fost capturate de exploziile de imagini rapide.
„Potențialul microscopiei inteligente include măsurarea a ceea ce achizițiile standard ar lipsi”, explică Manley. „Captăm mai multe evenimente, măsurăm constrângeri mai mici și putem urmări fiecare diviziune în detaliu.”
Detectarea diviziunii bacteriene
Apoi, cercetătorii au folosit EDA pentru a studia diviziunea celulară a bacteriilor C. crescentus. Ciclul celular bacterian are loc pe o scară de timp de zeci de minute, creând provocări distincte pentru microscopia cu celule vii. Ei au colectat date la o viteză lentă a imaginii de 6.7 cadre/oră, o viteză mare a imaginii de 20 de cadre/h sau o viteză variabilă comutată de EDA.
Echipa a descoperit că rețeaua de detectare a evenimentelor dezvoltată pentru constricțiile mitocondriale ar putea recunoaște etapele finale ale diviziunii bacteriene fără antrenament suplimentar - probabil datorită asemănărilor în forma constricției și prezenței unui marker molecular similar funcțional.
Tehnica de microscopie îmbunătățită vede celulele vii cu o sensibilitate de șapte ori mai mare
Din nou, EDA a redus fotoalbirea în comparație cu imagistica rapidă constantă și a măsurat constricțiile cu diametre medii semnificativ mai mici decât cu imagistica lentă constantă. EDA a permis realizarea de imagini a întregului ciclu celular și a oferit detalii despre diviziunea celulară bacteriană care sunt dificil de capturat folosind o viteză fixă de imagine..
spune Manley Lumea fizicii că echipa intenționează, de asemenea, să antreneze rețelele neuronale pentru a detecta diferite tipuri de evenimente și să le folosească pentru a evoca diferite răspunsuri hardware. „De exemplu, ne imaginăm valorificarea perturbațiilor optogenetice pentru a modula transcripția în momentele cheie ale diferențierii celulare”, explică ea. „Ne gândim, de asemenea, să folosim detectarea evenimentelor ca mijloc de comprimare a datelor, selectând pentru stocare sau analiză datele care sunt cele mai relevante pentru un anumit studiu.”
- Pentru a permite cercetătorilor să implementeze EDA pe o mare varietate de microscoape, echipa oferă cadrul de control ca un plug-in cu sursă deschisă pentru software-ul Micro-Manager.
